外周血單個核細胞NLRP3的表達與膿毒癥急性腎損傷發生及進展的相關性分析*

龔光遠，張文軍△，陳 蘭

1.重慶市綦江區人民醫院重癥醫學科，重慶 401420；2.重慶醫科大學附屬第一醫院重癥醫學科，重慶 400016

目前，隨著生物醫學研究的不斷深入，膿毒癥的發病機制已得到初步明確。但膿毒癥的病死率仍居高不下，膿毒癥作為一類急性炎癥性疾病，可通過激活炎性通路，導致重要臟器損傷。有研究顯示，腎臟是膿毒癥引起損傷的首要臟器，腎損傷發病急且進展快，是導致膿毒癥患者死亡的重要原因之一[1]。以往相關研究運用缺血-再灌注損傷來解釋膿毒癥急性腎損傷的發生機制，但隨著近年來相關研究的深入，發現感染后機體炎性反應的激活與放大導致的腎小管細胞損傷及過度凋亡是膿毒癥急性腎損傷發生與進展的重要機制[2]。核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白3(NLRP3)炎性小體及下游信號通路的激活是機體炎性反應持續及放大的重要原因之一，該信號通路與炎癥性疾病的發生及進展密切相關[3]。本研究通過觀察膿毒癥急性腎損傷患者外周血單個核細胞(PBMCs)中NLRP3表達水平，分析其與疾病發生及進展的相關性。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2016年2月至2020年1月重慶市綦江區人民醫院收治的膿毒癥急性腎損傷患者154例作為膿毒癥急性腎損傷組，普通膿毒癥患者55例作為普通膿毒癥組。膿毒癥急性腎損傷組中男79例，女75例；年齡41～82歲，中位年齡60.5歲。普通膿毒癥組中男29例，女26例；年齡42～81歲，中位年齡61.2歲。納入標準：診斷膿毒癥及膿毒癥急性腎損傷患者均需滿足膿毒癥國際共識指南[4]；膿毒癥急性腎損傷患者還需滿足膿毒癥急性腎損傷診斷標準[5]。排除標準：既往已存在腎功能不全的患者；合并自身免疫系統疾病的患者；合并惡性腫瘤的患者；近期有服用免疫抑制劑的患者。此外，選取同期門診體檢健康者50例為對照組。依據急性腎損傷診斷標準，包括血清肌酐(Cr)水平和尿量，將膿毒癥急性腎損傷組分為Ⅰ期組(51例)、Ⅱ期組(52例)和Ⅲ期組(51例)。根據患者臨床結局，分為存活組(124例)和死亡組(30例)。各組間及亞組間一般臨床資料(包括性別、年齡等)比較，差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。本研究獲得了重慶市綦江區人民醫院倫理委員會的批準。

1.2方法

1.2.1一般資料 患者入院24 h內收集一般臨床資料，如性別、年齡、膿毒癥感染病因(包括重癥肺炎、腹腔感染、膽道感染、外科創傷及其他)等，檢測患者肝功能、腎功能、血常規等指標，收集患者24 h尿量。

1.2.2分離外周血PBMCs 抽取靜脈血2 mL，置入乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管，隨后加入等體積淋巴細胞分離液，經混勻后離心，分離得到PBMCs。

1.2.3PBMCs中NLRP3和半胱氨酸蛋白酶-1(Caspase-1) mRNA相對表達水平的檢測 采用qRT-PCR檢測各組單個核細胞中NLRP3、Caspase-1的mRNA相對表達水平，具體步驟如下。在各組PBMCs試管中加入1 mL Trizol，經反復高速離心后提取總RNA，測定RNA含量。RNA反轉錄按反轉錄試劑盒(美國賽默飛公司)說明書進行。NLRP3上游引物為5′-CAT GAG TGC TGC TTC GAC AT-3′；下游引物為5′-GCT TCA GTC CCA CAC AGA-3′；Caspase-1上游引物為5′-ATC GCT TTC TGC TCT TCC AC-3′；下游引物為5′-TCC TCC ACA TCA CAG GAA CA-3′。內參GAPDH上游引物為5′-AGA CAG CCG CAT CTT CTT GT-3′；下游引物為5′-CTT GCC GTG GGT AGA GTC AT-3′。將反轉錄產物進行PCR反應，依據熒光定量PCR試劑盒說明書(美國賽默飛公司)建立25.0 μL反應體系，包括經焦碳酸二乙酯處理的水17.5 μL、10×Taq緩沖液2.5 μL、氯化鎂2.0 μL、脫氧核糖核苷三磷酸混合物0.5 μL、上下游引物各0.5 μL、Tap酶0.5 μL。擴增條件[6]：95 ℃預變性120 s，95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，70 ℃延伸30 s，共40個循環。以ΔΔCt來計算mRNA相對表達水平。

1.2.4外周血炎性因子水平的檢測 采用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測各組外周血白細胞介素-1β(IL-1β)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)水平，具體操作見試劑盒說明書(上海信帆生物公司)。簡要步驟如下：取各組空腹靜脈血4 mL，經1 500 r/min離心5 min后收集上清液；設置空白孔、標準孔及待測樣品孔，空白孔僅加入顯色液和終止液，標準孔加入不同水平標準品稀釋液，而待測樣品孔加入上清稀釋液；經室溫孵育、洗滌后，加入抗體工作液(100微升/孔)、顯色液(100微升/孔)、終止液(50微升/孔)，最后測定各組吸光度(A)450值。

2 結 果

2.1對照組、普通膿毒癥組及膿毒癥急性腎損傷組各指標比較 普通膿毒癥組和膿毒癥急性腎損傷組外周血NLRP3 mRNA、Caspase-1 mRNA、IL-1β及TNF-α水平均明顯高于對照組(P<0.05)；與對照組和普通膿毒癥組比較，膿毒癥急性腎損傷組上述指標明顯升高(P<0.05)，見表1。

表1 對照組、普通膿毒癥組及膿毒癥急性腎損傷組各指標比較

2.2膿毒癥不同感染病因患者之間各指標比較 膿毒癥不同感染病因患者之間外周血NLRP3 mRNA、Caspase-1 mRNA、IL-1β及TNF-α水平比較，差異無統計學意義(P>0.05)，見表2。

表2 不同病因膿毒癥患者組間各指標比較

2.3膿毒癥急性腎損傷不同分期組間各指標比較 根據膿毒癥急性腎損傷病情嚴重程度，不同分期組間外周血NLRP3 mRNA、Caspase-1 mRNA、IL-1β、TNF-α及Cr水平比較，差異有統計學意義(P<0.05)。其中，Ⅲ期組上述指標水平最高，Ⅱ期組次之，Ⅰ期組最低(P<0.05)，見表3。

表3 膿毒癥急性腎損傷不同分期組間各指標比較

2.4膿毒癥急性腎損傷不同預后組間各指標水平比較 與膿毒癥急性腎損傷存活組患者NLRP3 mRNA、Caspase-1 mRNA、IL-1β、TNF-α及Cr水平比較，死亡組患者上述指標明顯升高(P<0.05)，見表4。

表4 膿毒癥急性腎損傷不同預后組間各指標水平比較

2.5相關性分析 相關性分析顯示，膿毒癥急性腎損傷患者NLRP3 mRNA水平與Caspase-1 mRNA、IL-1β、TNF-α及Cr水平呈正相關(r=0.802、0.720、0.621、0.633，P<0.05)。

2.6NLRP3 mRNA水平區分膿毒癥是否并發腎損傷及評估膿毒癥急性腎損傷組預后的ROC曲線分析 以NLRP3 mRNA相對表達水平區分膿毒癥并發腎損傷與未并發腎損傷的AUC為0.787(95%CI：0.703～0.872)，最佳截斷值為2.31，其靈敏度和特異度分別為74.51%和74.55%，其AUC稍大于Cr、Caspase-1 mRNA、IL-1β和TNF-α，但差異無統計學意義(P>0.05)；以NLRP3 mRNA相對表達水平區分膿毒癥急性腎損傷組存活和死亡的AUC為0.872(95%CI：0.790～0.954)，最佳截斷值為2.65，其靈敏度和特異度分別為85.00%和75.55%，其AUC明顯大于Cr、Caspase-1 mRNA、IL-1β、TNF-α，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖1。

注：A為區分膿毒癥并發腎損傷與未并發腎損傷的ROC曲線；B為區分膿毒癥急性腎損傷組存活和死亡的ROC曲線。

3 討 論

急性腎損傷是膿毒癥最嚴重的并發癥之一，主要表現為腎功能進行性衰退，是預測膿毒癥患者死亡的獨立危險因素[7]。目前，隨著相關臨床研究的持續深入，已有研究者對常規指標如血清Cr及急性生理與慢性健康狀況評分(APACHEⅡ)等在膿毒癥急性腎損傷病情評估中的作用進行了相關研究，但上述指標靈敏度或特異度不高[8-9]。針對膿毒癥急性腎損傷，如何通過有效的指標來評估其病情及預后，是臨床面臨的重大難題。

目前，膿毒癥急性腎損傷的發病機制仍不明確，腎缺血再灌注損傷、氧化應激、內皮功能障礙及微小RNA等均可能參與了其發病過程[10-13]。隨著近年來相關研究的深入，研究者發現，炎性反應的激活與放大是膿毒癥發生及進展的重要因素，抑制炎性反應是膿毒癥臨床治療的重要手段[14]。免疫炎性小體的激活是促進下游炎癥級聯反應的啟動因子之一，在免疫炎性小體分類中，NLRP3是重要成員之一，參與了天然免疫系統的構建[15]。有研究者發現，NLRP3在細胞及動物實驗中可激活下游Caspase-1/IL-1β及TNF-α通路，是促進炎性反應的重要信號通路之一，抑制NLRP3的激活，可抑制炎性反應的靶點[16]。NLRP3可表達于人體外周血PBMCs，通過檢測PBMCs中NLRP3相對表達水平，可反映機體炎性反應強度。相關研究顯示，在急性胰腺炎患者中，PBMCs中NLRP3 mRNA相對表達水平明顯升高，其與患者病情嚴重程度及預后呈一定的相關性[17]。同樣作為炎癥性疾病之一，膿毒癥急性腎損傷患者外周血PBMCs中NLRP3及下游信號通路水平如何，目前尚不明確。本研究結果顯示，膿毒癥急性腎損傷患者NLRP3及下游炎性信號通路呈明顯激活狀態，主要表現為外周血PBMCs中NLRP3、Caspase-1 mRNA相對表達水平明顯升高。進一步檢測相關炎性細胞因子水平，外周血IL-1β和TNF-α水平也明顯升高，與NLRP3和Caspase-1變化趨勢一致。NLRP3炎性信號通路的激活，是膿毒癥急性腎損傷病情進展的重要因素，通過檢測不同嚴重程度患者NLRP3及下游相關指標水平，結果提示隨著患者病情進展，上述指標水平均進行性升高。相關動物實驗研究已表明，NLRP3的激活與急性腎損傷的作用機制與激活下游炎性通路，促進腎小管細胞發生凋亡或焦亡，破壞蛋白酶-抗蛋白酶平衡，降解細胞外基質有關[18-20]。既往發現的膿毒癥急性腎損傷預后評估的相關指標如血清Cr、尿蛋白等，特異度相對偏低，本研究ROC曲線分析顯示，NLRP3 mRNA對膿毒癥急性腎損傷預后的評估價值較高，其AUC大于血清Cr、Caspase-1 mRNA、IL-1β、TNF-α指標。

綜上所述，NLRP3下游信號通路的激活與膿毒癥急性腎損傷的發生及病情進展密切相關，外周血PBMCs中NLRP3 mRNA相對表達水平不僅可作為患者預后的評估指標，還可能成為未來該類疾病治療的靶點。但由于該研究入選患者樣本量偏少，下一步需要擴大樣本量，采取多中心聯合的方式加以驗證。