轉錄因子Nrf2促進內皮細胞存活和肺穩態的機制研究

葛亮 李光才 張明華 譚偉

缺血再灌注引起的急性肺損傷導致肺上皮和內皮細胞死亡并伴有炎癥[1]。急性肺損傷會促進和(或)使肺部發病機制(包括纖維化)永久化[2]。急性肺損傷會導致過度的炎性反應和氧化應激。氧化應激導致炎性細胞募集而導致炎癥，而炎性細胞引起氧化應激的誘導[3]。轉錄因子Nrf2誘導細胞保護性基因表達并賦予抗缺血性肺損傷的保護，并且Nrf2介導的信號傳導對于恢復肺損傷后的肺穩態也至關重要[4]。盡管已經報道過PI3K/AKT信號是肺上皮細胞中Nrf2激活所必需的，但是在缺血再灌注肺損傷和修復過程中PI3K/AKT-Nrf2串擾的重要性仍不清楚[5]。Nrf2是內源性抗氧化劑防御分子的關鍵調節劑之一[6]。Nrf2促進各種下游抗氧化劑基因的轉錄，包括血紅素加氧酶1(heme oxygenase 1，HO-1)，NAD(P) H:醌氧化還原酶1[NAD(P) H:quinone oxidoreductasel，Nqo1]和其他Ⅱ期抗氧化劑酶[7]。此外，Nrf2在保護腦細胞免受缺血性中風損傷中起重要作用[8]。Nrf2基因的敲除增加了缺血再灌注小鼠肺缺損。因此，本研究探討轉錄因子Nrf2通過在復氧過程中保護線粒體功能和DNA促進內皮細胞存活和肺穩態的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗小鼠與細胞培養 研究中使用20只野生型(Nrf2 +/+)和Nrf2缺乏(Nrf2-/-)小鼠CD-1/ICR株[購自南方醫科大學實驗動物管理中心，合格證號：SCXK(粵)2016-0041]，平均8～9周齡，雌性，25～30 g。每個籠子收容小鼠5只，期間小鼠可隨意獲得食物和水。使用改良方法分離小鼠肺血管內皮細胞(MLVEC)。在用氯胺酮(70 mg/kg)和甲苯噻嗪(10 mg/kg)的混合物麻醉后，向小鼠右心室(3～4周齡)灌注PBS，以清除肺部血液。將周圍的胸膜下肺組織切成小塊，并在含有20%胎牛血清，25 mmol/L HEPES，3.7 g/L NaHCO3、5 mg/ml肝素，1 mg/ml氫化可的松，80 mg/ml內皮細胞生長補充劑的DMEM中培養來自牛腦，5 mg/ml兩性霉素，0.01%氨芐西林/鏈霉素，在37℃和5%CO2的條件下放置60 h。除去組織切塊，在基礎培養基中培養貼壁細胞。Nrf2 siRNA購自Santa Cruz。按照說明以Xfect siRNA轉染試劑(Takara)進行siRNA的轉染。

1.2 小鼠與細胞復氧過程模型建立 亞匯合的細胞用含1%血清的DMEM/F-12培養基替換，并置于缺氧培養箱中2 h急性缺氧。腔室中充滿5%的CO2和氮氣的氣體混合物，以獲得1%的氧氣濃度，并進行連續監控。暴露后，將細胞保持在完全培養基中，在21%O2和5%CO2的氣氛中孵育，進行360 min的復氧。用異氟烷麻醉大鼠并仰臥位綁扎。隨后，由頸中線切口暴露頸總動脈，頸外動脈和頸內動脈。將腔內硅酮涂層燈絲插入頸總動脈內腔，然后將其輕輕推入頸內動脈，直至頸動脈分叉處約18 mm處，從而阻塞MCA。缺血2 h后，再次麻醉MCAO大鼠，并抽出細絲以恢復血流以進行再灌注。醫院倫理委員會批準該研究，動物實驗方案均經大學動物研究倫理委員會批準。

1.3 實驗分組 根據實驗要求，將實驗小鼠分為Nrf2基因敲除組(Nrf2-/-)和野生型組(Nrf2 +/+)，每組10只，培養的細胞為Nrf2 siRNA組。

1.4 實驗方法

1.4.1 氧化應激水平檢測:超氧化物歧化酶(SOD)：根據需要準備空白井，標準井，測定井和對照井。將細胞在37℃下孵育20 min。用酶標儀檢測每個孔在450 nm 的吸光度值。用酶標儀(1 cm的光路，用蒸餾水設定為零)檢測532 nm處每個孔的吸光度值。細胞內ROS的測定，使用活性氧分析試劑盒(beyotime，中國上海)評估ROS水平。在黑暗中將樣品與DCFH-DA在37℃下孵育45 min。然后，將樣品用PBS洗滌3次。使用酶標儀(Bio-Rad，CA，美國)在485 nm(激發)和535 nm(發射)下分析熒光。使用商品化的ELISA試劑盒(Cell Biolabs，美國)，根據制造商的說明測定谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)活性。

1.4.2 蛋白質免疫印跡:實驗結束時獲得支氣管肺泡灌洗液(BALF)，使用核和細胞質蛋白提取試劑盒分離肺組織中的細胞核和胞質蛋白。通過10%SDS-PAGE分離30 g蛋白質，然后轉移至硝酸纖維素膜(Millipore Corp，Bedford，MA)。封閉后，將免疫印跡與抗HO-1、Nqo1蛋白孵育過夜，再與辣根過氧化物酶偶聯的IgG二級抗體(Santa Cruz)在室溫孵育1 h。以增強的化學發光Western印跡檢測系統(Millipore)可視化免疫反應蛋白。使用光密度計(Syngene，Braintree，UK)、Genesnap和Genetools軟件(Syngene)測量條帶的染色強度。

1.4.3 線粒體損傷測評：使用常規螢光素-螢光素酶測定法(Roche Diagnostics，曼海姆，德國)檢測ATP釋放。BALF進行胰蛋白酶處理，后重懸于200 μl緩沖液(100 mmol/L Tris，4 mmol/L EDTA，pH值7.7)中。收集裂解物，并使用酶標儀(Bio-Rad，CA，USA)檢測ATP釋放。為了評估ATP的釋放，對樣品中檢測到的量進行總體積和時間的校正。線粒體膜電位(MMP)的測量，使用Rh123染色分析MMP。在37℃下將Rh123(10 μmol/L)加入肺泡灌洗液(BALF)30 min。使用顯微鏡在480 nm(激發)和530 nm(發射)下測量熒光。使用從R&D Systems(明尼阿波利斯，明尼蘇達州，美國)獲得的Quantikine M細胞色素C免疫測定試劑盒測量細胞質提取物的上清液和分離的線粒體懸液中的細胞質和線粒體級分中的細胞色素C水平。將裂解物以750 g離心10 min，并收集上清液。然后，將上清液在15 000 r/min離心，并將上清液用作線粒體級分。使用酶標儀在450和540 nm處測定吸光度。

1.4.4 肺組織病理學檢查：將肺組織用10%甲醛林固定并包埋在石蠟中，然后用蘇木精和曙紅(HE)染色4 mm切片。由2名在肺部病理學方面有專長的盲目病理學家對玻片的總表面進行評分。

1.4.5 MTT檢測細胞存活：使用Promega(英國南安普敦)CellTiter [3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧基甲氧基苯基)-2-(4-磺基苯基)-2H-四唑]進行細胞生存分析。析根據制造商的說明，通過記錄490 nm處的吸光度定量測定。細胞死亡百分比計算：細胞死亡= 100-(OD測試/OD對照×100)，其中對照代表在整個實驗期間僅在M199/20%FBS中培養的細胞。

1.5 肺部炎癥評分標準 0分：正常組織；1分：最小的炎癥變化；2分：輕度至中度的炎癥改變(對肺部結構無明顯損害)；3分：中度發炎性損傷(肺泡間隔增厚)；4分：中度至重度發炎性損傷(結節或肺炎區域的形成扭曲了正常結構)；5分：嚴重的炎癥損傷，視野完全消失。

2 結果

2.1 Nrf2減輕氧化應激反應 Nrf2基因敲除組較野生型組ROS水平升高(P<0.05)，SOD、GPx水平降低(P<0.05)。見表1。

表1 氧化應激水平測定

2.2 蛋白印跡分析 Nrf2基因敲除組較野生型組HO-1、Nqo1、PI3K/AKT的蛋白表達降低(P<0.05)。見表2。

表2 蛋白印跡分析

2.3 小鼠肺組織HE染色 Nrf2基因敲除組缺血灌注誘發急性肺損傷的特征是彌漫性間質性水腫，肺泡增厚，肺泡氣隙明顯減少，野生型組可抑制誘發的損傷。見圖1。

2.4 Nrf2保護復氧過程中線粒體損傷 Nrf2基因敲除組較野生型組細胞色素C水平升高(P<0.05)，ATP合成量、MMP電位水平降低(P<0.05)。見表3。

表3 Nrf2對線粒體功能的影響

2.5 細胞凋亡活力水平 Nrf2 siRNA組較正常培養細胞組細胞凋亡率升高(P<0.05)，細胞活力降低(P<0.05)。見表4。

表4 細胞凋亡活力水平

3 討論

氧化應激損傷在缺血再灌注的病理發展中起關鍵作用[9]。一項臨床研究證實尿液中的氧化應激生物標志物可以預測心肌梗死、中風和心血管疾病的死亡率，表明氧化還原系統失衡與病因有關[10]。本研究中，我們建立了腦缺血再灌注疾病引起的急性肺損傷小鼠模型，在復氧過程中發現小鼠體內ROS的增加和SOD活性的降低，HO-1和Nqo1抗氧化劑分子的水平升高，導致缺血性中風中氧化應激損傷的增長。Nrf2基因敲除組較野生型組ROS水平升高，SOD、GPx水平降低，說明Nrf2基因的保留緩解了復氧過程中的氧化應激反應。此外，我們發現野生型(Nrf2 +/+)小鼠中可以抑制ROS產生，上調SOD活性以及HO-1和Nqo1的中的蛋白表達來抵御氧化應激。Nrf2基因敲除組較野生型組HO-1、Nqo1、PI3K/AKT的蛋白表達降低。研究證實，Nrf2的喪失會加重MCAO大鼠的腦梗死和神經功能缺損[11]。因此，Nrf2信號通路在缺血性中風損害的抑制中起至關重要的作用[12]。在正常的生理條件下，Nrf2與細胞質中的天然抑制劑Keap1結合以維持活性的穩定性。響應各種蛋白激酶對細胞的損傷和(或)磷酸化，Nrf2被激活并從Keap1釋放[13]。PI3K/Akt通路參與Nrf2在ser 40的磷酸化，而PI3K或Akt的抑制會減弱Nrf2的激活。從Keap1釋放后，p-Nrf2在細胞質中被激活，轉入細胞核，與bZIP蛋白(如Maf蛋白)異源二聚體，并識別適當的ARE序列[14]。結果，它啟動了在啟動子區域包含ARE的一系列抗氧化基因的轉錄，包括SOD、HO-1、Nqo1和GST。這些抗氧化劑分子通過各種酶催化反應保護細胞免受氧化應激。SOD催化O2的歧化，形成O2和H2O2，然后轉化為水的最終產物[15]。HO-1催化血紅素氧化為游離鐵，聯運膽素和一氧化碳。而且，Nqo1催化參與生成ROS的醌的雙電子還原[16]。本研究結果表明，野生型(Nrf2 +/+)小鼠激活PI3K/Akt蛋白激酶磷酸化，然后促進HO-1、Nqo1、SOD等蛋白的表達，從而抑制缺血再灌注的氧化應激損傷。

當內源性抗氧化因子減少時，氧化應激誘導細胞凋亡。本研究表明，Nrf2 siRNA組的細胞凋亡率升高。線粒體是ROS產生的關鍵來源。但是，這些細胞器極易受到氧化應激的影響，這會觸發mtDNA的突變并調節膜的通透性。本研究中，Nrf2缺乏(Nrf2-/-)的小鼠MMP崩潰，細胞色素C釋放和線粒體ATP生成減少。額外的線粒體生物發生增強了線粒體ATP的產生，這是線粒體功能的關鍵指標。線粒體的生物發生包括線粒體的生長和分裂。線粒體功能通過不斷重塑線粒體的生物發生來適應各種應激條件。

綜上所述，Nrf2在機體復氧過程中可降低氧化應激反應，抑制線粒體功能受損，促進內皮細胞的生存從而保護肺穩態。