海金沙提取物對阻塞性黃疸大鼠PERK/eIF2α/CHOP通路及肝纖維化的影響

李媛 李屹 張曄 劉永林

阻塞性黃疸(obstructive jaundice，OJ)是指膽汁排泄受阻，膽汁不能排入十二指腸而造成膽汁淤積，引起黃疸的常見肝膽外科病癥，可使肝臟受損嚴重，引起纖維化[1,2]。器官纖維化的發生發展與內質網應激密切相關[3,4]，內質網應激時激活PKR樣內質網激酶(PKR-like ER kinase，PERK)，促進真核翻譯起始因子2α(eukaryotic translation initiation factor-2alpha，eIF2α)磷酸化[5]，激活下游因子轉錄激活因子4(activating transcription factor 4，ATF4)，從而激活C/EBP同源蛋白(C/EB phomologous protein，CHOP)[6,7]。中藥海金沙為海金沙科海金沙屬多年生蕨類植物，可全草入藥[8]。目前對其藥理活性的研究主要在抗氧化、抗菌、抗病毒、利膽、排石等方面，但作為傳統中藥，海金沙的功能仍有待進一步開發研究。本實驗通過建立阻塞性黃疸大鼠模型，初步探究海金沙提取對阻塞性黃疸大鼠PERK/eIF2α/CHOP通路及肝纖維化的影響，為臨床治療提供可靠的理論依據和實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SD雄性大鼠，SPF級，體重200 g左右，購自遼寧省實驗動物資源中心，生產許可證號為SCXK(遼)2015-0001。

1.2 實驗試劑 伊紅蘇木精試劑盒、TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒、蛋白提取試劑盒購自上海Beyotime公司；PERK抗體、eIF2α抗體、CHOP抗體、酶聯免疫試劑盒均購自英國Abcam公司。

1.3 主要儀器 全自動生化分析儀購自美國Rayto公司；光學顯微鏡購自日本尼康公司；蛋白電泳儀、半干轉膜儀購自美國Bio-Rad公司；凝膠成像儀購自杭州Miulab公司。

1.4 方法

1.4.1 海金沙的提取:參照文獻[9]，制備海金沙提取物。海金沙全草粉碎，稱取100 g，置于500 ml圓底燒瓶，加入純化水400 ml，回流提取4次，2 h/次，合并提取液并濃縮。濃縮后加入95%乙醇沉淀，使乙醇含量達到80%，靜置抽濾，室溫干燥濾液，得到總膏，提取率約為2%。

1.4.2 阻塞性黃疸大鼠模型的制備:取健康雄性SD大鼠最少50只，隨機分成5組：即假手術組、模型組、海金沙低劑量組、海金沙中劑量組、海金沙高劑量組，每組10只。參照文獻制備阻塞性黃疸大鼠[10]，方法如下：按照45 mg/kg劑量的2%戊巴比妥鈉腹腔注射，麻醉大鼠，打開腹腔，沿肝十二指腸韌帶尋找膽總管。將大鼠膽總管在十二指腸上方雙重結扎中間剪斷，關閉腹腔，從而建立膽道阻塞動物模型。假手術組大鼠僅游離膽總管但并不結扎。所有大鼠術后需做抗菌消炎處理。實驗過程中，所有因手術、麻醉意外等原因死亡的動物，均應剔除出組，并采用備用大鼠補充，保證每組動物存活只數≥10只。

1.4.3 動物給藥:用蒸餾水將海金沙提取物分別配制為5、10、15 mg/ml溶液，海金沙低劑量組(50 mg/kg)、中劑量組(100 mg/kg)、高劑量組(150 mg/kg)按照10 ml/kg劑量給大鼠灌胃，假手術組和模型組給予等體積的蒸餾水灌胃，1次/d，連續4周。

1.4.4 血清肝功能指標檢測:將大鼠深度麻醉，打開腹腔，從肝下門靜脈采集血液，離心收集血清，全自動生化分析儀檢測大鼠肝功能指標，丙氨酸氨基轉移酶(Alanine aminotransferase，ALT)、天門冬氨酸氨基轉移酶(Aspartate aminotransferase，AST)、總膽紅素(total bilirubin，TBIL)。

1.4.5 血清肝纖維化指標檢測:采用酶聯免疫吸附法(ELISA)對血清中的肝纖維化指標進行檢測，其中包括層黏連蛋白(Laminin，LN)，透明質酸酶(Hyaluronidase，HA)，Ⅲ型前膠原(Type Ⅲ procollagen，PCⅢ)，Ⅳ型膠原(Type Ⅳ collagen，Ⅳ-Col)。

1.4.6 大鼠肝臟組織的病理學觀察和肝纖維化程度:處死大鼠，取出大鼠部分肝臟組織固定，制備病理組織切片，HE染色，光學顯微鏡下觀察病理形態。另一部分肝臟組織至液氮中保存備用。肝纖維化分級標準[11]：肝臟組織內無纖維化為0級；肝竇周圍、匯管區纖維化或肝小葉中出現纖維瘢痕為1級；大部分肝小葉結構完整，但能夠看到纖維間隔為2級；肝小葉結構紊亂，纖維間隔較多，但沒有肝硬化為3級；肝實質受損，纖維彌漫性增生，產生假小葉，肝硬化前期為4級。

1.4.7 肝臟組織細胞凋亡率的檢測:利用TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒對大鼠肝臟細胞凋亡情況進行檢測。顯微鏡下觀察細胞核呈棕黃色的凋亡細胞。每個試驗組分別隨機選取10張切片，每張切片選擇10個具有代表性的高倍視野(×400)，計數陽性細胞數，細胞凋亡率=凋亡細胞數/細胞總數×100%。

1.4.8 Western blot檢測肝臟組織中PERK、eIF2α、CHOP蛋白的相對表達量:從液氮中取出保存的肝臟組織，提取總蛋白檢測PERK、eIF2α、CHOP蛋白的相對表達情況，其中，β-actin蛋白作為內參蛋白。

2 結果

2.1 大鼠形態觀察 術后24 h，模型組和藥物處理組大鼠尿液顏色明顯加深。48 h后，大鼠尾巴和耳朵出現黃染，隨著膽管阻塞時間越來越長，癥狀越來越明顯，食欲下降，精神萎靡不振。隨機抽取大鼠解剖可發現，膽管畸形擴張，肝臟腫大，血液生化指標顯示膽紅素水平超標，由此，可判斷為造模成功。連續灌胃4周后發現，藥物處理組大鼠黃染癥狀減退，與模型組有明顯區別。

2.2 大鼠血清肝功能指標比較 與假手術組相比，模型組ALT、AST及TBIL含量顯著升高(P<0.05)。與模型組相比，海金沙處理組ALT、AST及TBIL含量明顯下降，且呈劑量依賴性(P<0.05)。見表1。

表1 5組大鼠血清中ALT、AST及TBIL比較

2.3 血清肝纖維化指標比較 模型組LN、HA、PCⅢ、Ⅳ-Col水平明顯高于假手術組(P<0.05)。與模型組相比，海金沙低、中、高劑量LN、HA、PCⅢ、Ⅳ-Col水平依次降低且呈劑量依賴性(P<0.05)。見表2。

表2 5組大鼠血清中LN、HA、PCⅢ、Ⅳ-Col比較

2.4 5組大鼠肝臟組織病理形態及肝纖維分級情況 假手術組大鼠肝小葉結構正常，肝竇正常，肝細胞排列規則，細胞核清晰，呈放射狀，無明顯炎細胞和纖維組織增生。模型組大鼠肝小葉受到嚴重破壞，肝竇充血，肝細胞受到嚴重損傷，小葉間膽管及纖維組織增生，炎性細胞浸潤，出現大面積壞死。海金沙高劑量組的肝小葉受損較輕微，肝細胞排列趨于正常，僅有少量炎性細胞浸潤和膽管、纖維組織增生。與假手術組比較，模型組大鼠纖維化分級顯著上升(P<0.05)；與模型組相比，海金沙低中高劑量組的分級評分顯著下降且呈劑量依賴性(P<0.05)。見圖1，表3。

表3 5組大鼠肝纖維化分級比較

2.5 海金沙對大鼠肝臟組織細胞凋亡的影響 與假手術組相比，模型組肝臟細胞凋亡率明顯升高(P<0.05)。海金沙處理后，肝臟細胞的凋亡率明顯下降，且呈劑量依賴性(P<0.05)。見表4。

表4 5組大鼠肝臟組織細胞凋亡率檢測結果

2.6 5組大鼠肝臟中PERK、eIF2α、CHOP蛋白表達變化 與假手術組相比，模型組PERK、eIF2α、CHOP蛋白相對表達量顯著升高(P<0.05)。與模型組相比，海金沙處理組的PERK、eIF2α、CHOP蛋白相對表達量明顯下降且呈劑量依賴性(P<0.05)。見表5，圖2。

表5 5組大鼠肝臟組織PERK、eIF2α、CHOP蛋白表達

圖2 5組大鼠肝臟組織WB檢測結果；1 假手術組；2 模型組；3 海金沙低劑量組；4 海金沙中劑量組；5 海金沙高劑量組

3 討論

阻塞性黃疸是膽汁酸排出受阻形成淤積，并對肝及其他器官產生的一系列損傷[12-14]，臨床表現為血清中ALT、AST、TBIL明顯超過正常值。本實驗采取結扎膽總管方法建立阻塞性黃疸大鼠模型，結果顯示大鼠肝小葉結構受損嚴重，肝細胞大量壞死，炎性細胞浸潤，小葉間膽管及纖維組織增生，血清中肝功能指標ALT、AST、TBIL及肝纖維指標LN、HA、PCⅢ、Ⅳ-Col水平明顯升高，表明阻塞性黃疸可引發大鼠肝功能受損，肝臟纖維化，造成肝功能障礙，揭示模型建立成功。

海金沙，又稱迷離網、雞膠莽、洗碗藤、金砂蕨等。其根狀莖橫走，葉軸攀援纏繞狀，孢子囊兩行并生，呈穗狀[15]。傳統中藥常以海金沙全草或干燥孢子入藥，其味甘淡、性寒，有清熱解毒、活血通絡、利濕利膽消腫的功效[16]。海金沙的利膽作用常用做治療膽囊炎，并與其他中藥相輔活血化瘀[17]。在本實驗中采用水提醇沉法，從海金沙中提取活性成分，研究海金沙提取對阻塞性黃疸大鼠的防治作用。本研究結果顯示，經海金沙提取物處理后，阻塞性黃疸大鼠肝組織病理損傷及纖維化程度減輕，肝細胞凋亡數量減少，血清中ALT、AST、TBIL、LN、HA、PCⅢ 及 Ⅳ-Col水平降低，且呈劑量依賴性，表明海金沙可減輕阻塞性黃疸大鼠肝組織病理損傷，改善肝功能，并隨劑量升高而作用增強。

肝纖維化的發生與肝細胞的凋亡密切相關，抑制肝細胞凋亡可有效防止肝纖維的進展[18]。嚴重或長時間的內質網應激將激活凋亡信號通路誘導細胞凋亡，其中包括PERK/eIF2α/CHOP通路[19]。本研究結果顯示，與假手術組相比，模型組大鼠肝組織中PERK、eIF2α、CHOP蛋白表達升高，提示內質網應激的標志性蛋白PERK表達增強，以及eIF2α、CHOP表達明顯增加，說明在阻塞性黃疸肝纖維化過程中發生了內質網應激，可能導致肝細胞凋亡。李木松等[18]研究發現，茵陳蒿湯可通過抑制PERK、eIF2α和ATF4的活化，減少肝細胞凋亡，進而抑制內質網應激在膽汁淤積性肝纖維化中的促進作用。本研究采用海金沙處理后，阻塞性黃疸大鼠肝組織PERK、eIF2α、CHOP蛋白表達降低，且隨著藥物劑量的增大而更加顯著，表明海金沙可下調PERK/eIF2α/CHOP通路相關蛋白表達，提示海金沙減輕肝組織病理損傷，延緩細胞凋亡，修復肝功能的作用與抑制PERK/eIF2α/CHOP通路有關。

綜上所述，海金沙可能通過抑制PERK/eIF2α/CHOP通路，降低阻塞性黃疸大鼠肝組織中纖維化水平，減輕肝細胞凋亡，改善肝功能，為臨床治療阻塞性黃疸的治療提供了新思路。