下調(diào)GIT1對乳腺癌MCF-7細(xì)胞增殖、凋亡能力及周期分布的影響

繆文青 張陽 嚴(yán)海冬

臨床醫(yī)學(xué)將發(fā)生于機(jī)體乳腺上皮組織的惡性腫瘤稱為乳腺癌，是一種臨床較為常用的惡性腫瘤[1]。乳腺癌患者主要臨床表現(xiàn)為乳腺腫塊、乳頭溢液等，嚴(yán)重威脅患者身體健康[2,3]。乳腺癌癥狀發(fā)病具有較為明顯的性別差異，據(jù)世界衛(wèi)生組織調(diào)查數(shù)據(jù)顯示，99%左右的乳腺癌患者為女性[4,5]。在歐美地區(qū)，乳腺癌發(fā)病率高達(dá)15%左右，相比之下，我國乳腺癌發(fā)病率較低，但是近年來一直呈現(xiàn)上升趨勢，作為一項(xiàng)公共衛(wèi)生問題引起廣大專家的關(guān)注，許多學(xué)者致力于乳腺癌臨床治療的研究[6,7]。本文研究中設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，對乳腺癌MCF-7細(xì)胞中GIT1蛋白表達(dá)進(jìn)行靶向調(diào)控，旨在探究下調(diào)GIT1對乳腺癌MCF-7細(xì)胞增殖、凋亡能力及周期分布的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 研究細(xì)胞：乳腺癌MCF-7細(xì)胞(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院)。兔抗小鼠Bcl-2、Bax抗體(Sigma公司)；大鼠抗小鼠caspase3抗體(Gibco 公司)；小鼠抗大鼠MMP-9抗體(Hyclone公司)；兔抗大鼠ICAM-1抗體(BD公司)。本實(shí)驗(yàn)獲我院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng):在40℃的環(huán)境中對凍存的乳腺癌MCF-7細(xì)胞進(jìn)行火浴處理(40℃)，之后進(jìn)行充分搖晃，將搖晃均勻的乳腺癌MCF-7細(xì)胞置于2 ml的培養(yǎng)基(10%PBS、1%雙抗(青鏈霉素)RPMI-1640培養(yǎng)基500 ml)之內(nèi)，之后使用2 000 r/min的離心機(jī)進(jìn)行離心處理，進(jìn)行重懸處理后將細(xì)胞傳代，使用CO2培養(yǎng)箱對培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h、換液，細(xì)胞融合率達(dá)90%后傳代。

1.2.2 慢病毒載體構(gòu)建及分組:GIT1基因序列根據(jù)質(zhì)粒特點(diǎn)進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，引入SacⅠ酶切位點(diǎn)(由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成)，GIT1下游序列：5’-GGTTGACTGGCAGGAAGG-3’。GIT1上游序列：5’-ATGGATGTGTATGACGAAGTG-3’。正反鏈混合后加入退火緩沖液，96℃反應(yīng)4 min，室溫冷卻，生成雙鏈。使用Eco31Ⅰ酶切線性化質(zhì)粒pGenesil-1，100倍稀釋退火產(chǎn)物之后與其連接，20℃下水浴孵育過夜，使用大腸桿菌DH5α轉(zhuǎn)化，第2天選擇單克隆菌落，在30 μg/ml Kana的LB培養(yǎng)液中接種，2 000 r/min離心處理，37℃下震混，孵育過夜。少量抽提質(zhì)粒后使用SacⅠ酶切進(jìn)行鑒定(由寶生物工程(大連)有限公司完成)，分為空白組、上調(diào)GIT1組和下調(diào)GIT1組,重懸處理后分別加入4 μg 0.9%氯化鈉溶液、pcDNA3.1-GIT1、GIT1siRNA，電擊處理后室溫環(huán)境下存放120 min，將3組細(xì)胞加入6孔、96孔培養(yǎng)板中，置于培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)取出后加入含800 μg/ml G418的培養(yǎng)基再次培養(yǎng)。

1.2.3 細(xì)胞增殖檢測:MTT法檢測3組細(xì)胞增殖能力。將3組細(xì)胞加入96孔板中，分別于12、24、48、72 h 后在每孔中加入30 μl的MTT液，37℃孵育4 h，棄培養(yǎng)液，加入150 μl的DMSO，酶標(biāo)儀在498波長處檢測每孔OD值。

1.2.4 TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡情況:常溫環(huán)境中使用20 μg/ml蛋白酶K培養(yǎng)0.5 h后去除蛋白，使用PBS緩沖液進(jìn)行徹底清洗，之后將平衡緩沖液100 μl加入其中，室溫環(huán)境中平衡10 min，之后滴入TdT酶反應(yīng)液100 μl，避光、室溫環(huán)境中孵育1 h，之后加入100 μl SSC溶液，常溫環(huán)境中靜置20 min后進(jìn)行清洗3次，之后使用DAPI進(jìn)行復(fù)染，避光培養(yǎng)10 min后再次進(jìn)行浸洗，封片觀察。DAPI復(fù)染細(xì)胞核呈藍(lán)色，凋亡細(xì)胞細(xì)胞核呈綠色，取每切片3視野進(jìn)行觀察、計(jì)算細(xì)胞凋亡率，計(jì)算平均值。

1.2.5 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期分布：將3組細(xì)胞傳代至5孔板，并將其置于5% CO2、37℃環(huán)境中培養(yǎng)，之后添加0.25%胰蛋白酶進(jìn)行消化，離心處理10 min，使用PBS緩沖液進(jìn)行清洗，再次離心處理，之后添加1 ml PI染液，置于常溫、避光環(huán)境60 min，進(jìn)行特異熒光標(biāo)記后按照流式細(xì)胞儀操作方法檢測細(xì)胞周期分布。

1.2.6 細(xì)胞侵襲情況:使用Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測。2 h前濕化小室。上室加入細(xì)胞懸液200 μl，在下室加入含10%胎牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)液，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。用PBS沖洗2次后置于4%多聚甲醛中30 min。染色后放在顯微鏡下觀察計(jì)數(shù)。

1.2.7 細(xì)胞遷移情況:使用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測。將細(xì)胞使用胰酶消化制成細(xì)胞懸液，接種于6孔板。使用10槍尖垂直于孔板底部畫直線，PBS緩沖液清洗3次。常溫培養(yǎng)24 h拍照計(jì)算劃痕。

1.2.8 Western blot法檢測Bcl-2、Bax、caspase-3、MMP-9、ICAM-1表達(dá):使用PBS緩沖液對標(biāo)本沖洗之后裂解30 min，測定蛋白濃度。取20 μg/孔蛋白質(zhì)，添加蛋白緩沖液后進(jìn)行電泳，10 min后將電轉(zhuǎn)膜置于10%的牛奶中浸泡，常溫環(huán)境下封閉90 min。之后結(jié)合一抗、稀釋，孵育1 d，取出后使用TBST液沖洗，結(jié)合二抗，60 min后清洗、顯色，對Bcl-2、Bax、caspase-3、MMP-9、ICAM-1相對表達(dá)量進(jìn)行檢測。

2 結(jié)果

2.1 3組細(xì)胞增殖率、凋亡率比較 在第24、48、72小時(shí)，上調(diào)GIT1組細(xì)胞增殖率高于空白組，凋亡率低于空白組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；下調(diào)GIT1組細(xì)胞增殖率低于空白組、上調(diào)GIT1組，凋亡率高于空白組、上調(diào)GIT1組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 3組細(xì)胞增殖率、凋亡率比較

2.2 3組細(xì)胞周期分布情況比較 上調(diào)GIT1組處于G1期的細(xì)胞比例低于空白組，處于S、G2期的細(xì)胞比例高于空白組，且下調(diào)GIT1組處于G1期的細(xì)胞比例均高于空白組、上調(diào)GIT1組，處于S、G2期的細(xì)胞比例低于空白組、上調(diào)GIT1組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 3組細(xì)胞周期分布情況比較

2.3 3組細(xì)胞侵襲、遷移能力比較 上調(diào)GIT1組細(xì)胞侵襲細(xì)胞數(shù)、遷移細(xì)胞數(shù)均高于空白組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；下調(diào)GIT1組細(xì)胞侵襲細(xì)胞數(shù)、遷移細(xì)胞數(shù)均低于空白組、上調(diào)GIT1組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3，圖1、2。

表3 3組細(xì)胞侵襲、遷移能力比較 個,

2.4 3組細(xì)胞Bcl-2、Bax、caspase-3相對表達(dá)量比較 上調(diào)GIT1組細(xì)胞Bcl-2相對表達(dá)量低于空白組，Bax、caspase-3相對表達(dá)量高于空白組，且下調(diào)GIT1組細(xì)胞Bcl-2相對表達(dá)量高于空白組、上調(diào)GIT1組，Bax、caspase-3相對表達(dá)量均低于空白組、上調(diào)GIT1組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表4，圖3。

圖3 Bcl-2、Bax、caspase-3表達(dá)WB圖；A 空白組；B 上調(diào)GIT1組；C 下調(diào)GIT1組

表4 3組細(xì)胞Bcl-2、Bax、caspase-3相對表達(dá)量比較

2.5 3組細(xì)胞MMP-9、ICAM-1相對表達(dá)量比較 上調(diào)GIT1組細(xì)胞MMP-9、ICAM-1相對表達(dá)量均高于空白組，且下調(diào)GIT1組細(xì)胞MMP-9、ICAM-1相對表達(dá)量均低于空白組、上調(diào)GIT1組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表5，圖4。

表5 3組細(xì)胞MMP-9、ICAM-1相對表達(dá)量比較

圖4 MMP-9、ICAM-1表達(dá)WB圖;A 空白組；B 上調(diào)GIT1組；C 下調(diào)GIT1組

3 討論

有學(xué)者認(rèn)為乳腺癌癥狀的發(fā)生具有一定的規(guī)律性，并總結(jié)了許多乳腺癌發(fā)病高危因素，但目前臨床醫(yī)學(xué)尚未將乳腺癌癥狀的發(fā)病機(jī)制研究透徹[8,9]。有專家學(xué)者致力于乳腺癌癥狀發(fā)病機(jī)制、治療方法的研究，旨在尋找一個有效的治療靶點(diǎn)對乳腺癌癥狀進(jìn)行治療[10,11]。作為一種多區(qū)域骨架蛋白，GIT1表達(dá)的變化與細(xì)胞增殖、凋亡能力具有密切聯(lián)系。有學(xué)者在研究中表示，GIT1在HeLa細(xì)胞中呈現(xiàn)高表達(dá)，下調(diào)GIT1表達(dá)對細(xì)胞增殖、遷移具有一定的抑制作用。但是目前關(guān)于調(diào)控GIT1表達(dá)對乳腺癌MCF-7細(xì)胞增殖、凋亡能力、周期分布等生物學(xué)行為影響的研究鮮有報(bào)道。

癌組織的發(fā)生發(fā)展與細(xì)胞增殖、凋亡能力的變化密切相關(guān)[12]。有研究表明，乳腺癌組織細(xì)胞增殖率較高、凋亡率較低，調(diào)控乳腺癌癌細(xì)胞增殖、凋亡能力對乳腺癌組織發(fā)生發(fā)展具有重要的抑制作用，是臨床治療乳腺癌的關(guān)鍵[13]。本文研究結(jié)果顯示，下調(diào)GIT1蛋白表達(dá)的乳腺癌MCF-7細(xì)胞增殖率相對較低、凋亡率相對較高，說明下調(diào)GIT1蛋白表達(dá)能夠有效抑制乳腺癌MCF-7細(xì)胞增殖、促進(jìn)乳腺癌MCF-7細(xì)胞凋亡，從而抑制乳腺癌MCF-7細(xì)胞的不斷增殖、發(fā)展。

細(xì)胞活動的基礎(chǔ)生物學(xué)行為是周期分布，細(xì)胞周期分布的變化與細(xì)胞增殖、凋亡狀況的變化密切相關(guān)[14,15]。細(xì)胞周期分為DNA合成前期、合成期、合成后期，將癌細(xì)胞阻滯在DNA合成前期，能夠有效抑制癌細(xì)胞增殖、擴(kuò)散。本文研究結(jié)果顯示，下調(diào)GIT1蛋白表達(dá)的乳腺癌MCF-7細(xì)胞處于G1期的細(xì)胞比例較高，處于S、G2期的細(xì)胞比例較低，說明下調(diào)GIT1蛋白表達(dá)能夠阻滯乳腺癌細(xì)胞周期分布，抑制乳腺癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞凋亡，從而影響乳腺癌細(xì)胞的不斷發(fā)展。

有研究表明，癌細(xì)胞的不斷發(fā)展擴(kuò)散與其不斷侵襲、遷移具有密切聯(lián)系，抑制癌細(xì)胞的侵襲、遷移是抑制癌組織不斷生長、擴(kuò)散的關(guān)鍵[16,17]。本文研究結(jié)果顯示，下調(diào)GIT1蛋白表達(dá)的乳腺癌MCF-7細(xì)胞侵襲、遷移細(xì)胞數(shù)相對較少，說明下調(diào)GIT1蛋白表達(dá)能夠抑制乳腺癌細(xì)胞的侵襲、遷移。

癌細(xì)胞增殖、凋亡能力的變化與細(xì)胞凋亡蛋白相對表達(dá)量的變化密切相關(guān)。Bcl-2、Bax是線粒體細(xì)胞凋亡通路中的重要基因，二者表達(dá)的變化與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)[18,19]。caspase-3作為caspase家族重要成員，與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)[20]。本文研究結(jié)果顯示，下調(diào)GIT1蛋白表達(dá)的乳腺癌MCF-7細(xì)胞Bcl-2相對表達(dá)量較高，Bax、caspase-3相對表達(dá)量較低，說明下調(diào)GIT1蛋白表達(dá)能夠調(diào)控細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax、caspase-3的表達(dá)，從而起到促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞凋亡、抑制乳腺癌細(xì)胞增殖、發(fā)展的作用。ICAM-1、MMP-9表達(dá)的變化與癌細(xì)胞侵襲、遷移能力具有密切聯(lián)系[21,22]。本文研究結(jié)果顯示，下調(diào)GIT1蛋白表達(dá)的乳腺癌MCF-7細(xì)胞ICAM-1、MMP-9相對表達(dá)量相對較低，說明下調(diào)GIT1蛋白表達(dá)能夠下調(diào)ICAM-1、MMP-9相對表達(dá)量，從而起到抑制乳腺癌細(xì)胞侵襲、遷移的作用。

綜上所述，下調(diào)GIT1蛋白的表達(dá)能夠抑制乳腺癌MCF-7細(xì)胞增殖、侵襲、遷移，調(diào)控細(xì)胞周期分布，促進(jìn)乳腺癌MCF-7細(xì)胞凋亡，調(diào)控Bcl-2、Bax、caspase-3、MMP-9、ICAM-1蛋白相對表達(dá)量，為乳腺癌的臨床治療提供一定的參考依據(jù)。