LncRNA KIF9-AS1靶向miR-152-3p調控肺癌細胞的順鉑敏感性

王慧 張佳文 王健美 張薇

長期以來，以順鉑為基礎的治療一直是臨床肺癌化療的重要方案，然而由于順鉑內在或獲得性耐藥的限制，多數肺癌患者的化療以失敗告終[1]。因此，闡明肺癌順鉑耐藥的分子機制、探索有效的逆轉順鉑耐藥的方法，對改善肺癌患者的預后意義重大。長鏈非編碼RNA(lncRNA)被定義為長度>200個核苷酸的真核生物轉錄本，其通過染色質修飾、轉錄和轉錄后機制充當基因表達的關鍵調節劑，廣泛參與癌細胞的增殖、侵襲、轉移和耐藥生理病理過程[2,3]。LncRNA驅動蛋白家族成員9反義RNA1(KIF9-AS1)位于染色體3p21.31位點，研究顯示KIF9-AS1可增強細胞活力，抑制細胞凋亡，在腎細胞癌對索拉非尼的耐藥性中發揮了積極作用[4]。然而，KIF9-AS1在肺癌順鉑耐藥中的作用和潛在機制知之甚少。本研究通過檢測肺癌順鉑耐藥細胞(A549/DDP)中KIF9-AS1表達水平，探討下調KIF9-AS1表達對A549/DDP細胞增殖、凋亡和順鉑耐藥的影響，分析其下游潛在靶基因，以期為克服臨床肺癌順鉑耐藥提供有效靶點。

1 材料與方法

1.1 材料 人肺癌細胞A549、A549順鉑耐藥細胞株(A549/DDP)購自上海北諾生物科技公司；RPMI-1640培養基、胎牛血清、青鏈霉素雙抗購自武漢純度生物科技有限公司；逆轉錄試劑盒、SYBR Green PCR Master Mix購自大連TAKARA生物科技公司；Lipofectamine 2000、TRIzol試劑購于上?？泼羯?；miR-152-3p模擬物(miR-152-3p mimics)及其陰性對照、miR-152-3p抑制物(anti-miR-152-3p)及其陰性對照(anti-miR-NC)、KIF9-AS1小干擾RNA(si-KIF9-AS1)、無序陰性對照(si-NC)、KIF9-AS1過表達質粒(pcDNA-KIF9-AS1)及其陰性對照(pcDNA-NC)、雙熒光素酶報告基因載體由上海吉凱基因提供；細胞計數試劑盒(CCK-8)、膜聯蛋白V-異硫氰酸熒光素/碘化丙啶(Annexin-V-FITC/PI)試劑盒購于上海貝博生物公司；多藥耐藥相關蛋白1(MRP1)、細胞周期素D1(CyclinD1)和裂解的半胱氨酸蛋白酶3(Cleaved-caspase-3)兔源單克隆抗體購自上海艾博抗生物技術公司；

1.2 方法

1.2.1 細胞培養:A549/DDP、A549細胞均采用RPMI-1640培養基(補充10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 mg/L鏈霉素)進行常規培養。培養A549/DDP細胞時加入5 μmol/L順鉑以維持其順鉑耐藥性。

1.2.2 實時熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測KIF9-AS1和miR-152-3p表達:TRIzol法分別提取A549、A549/DDP細胞中總RNA。根據逆轉錄試劑盒將1 μg RNA反轉錄成cDNA。使用SYBR Green PCR Master Mix配置25 μl反應體系，在ABI 7500上進行實時RT-qPCR擴增。2-ΔΔCt公式計算KIF9-AS1和miR-152-3p的相對表達量。引物序列如下：KIF9-AS1上游引物5’-AGTC

CTTCCCATTCACAGGG-3’，下游引物5’-GCCCTCTTC

TT CCTCCACAT-3’；內參β-actin上游引物5’-TCACC

CACACTGTGCC CATCTACGA-3’，下游引物5’-CAGC

GGAACCGCTCATTGCCAATGG-3’；miR-152-3p上游引物5’-TCGGCAGG TCAGTGCATGACAGAA-3’，下游引物5’-CTCAACTGGTGTCGTGGA-3’；U6上游引物5’-GAGGGCCTATTTCCCATGATT-3’，下游引物5’-TAATTAGAATTAATTTGACT-3’。

1.2.3 細胞轉染和實驗分組:將對數期A549/DDP細胞接種6孔板，當細胞50%融合時利用Lipofectamine 2000將si-NC、si-KIF9-AS1、miR-NC、miR-152-3p mimics分別轉染A549/DDP細胞，依次記為si-NC組、si-KIF9-AS1組、miR-NC組、miR-152-3p組。為證實KIF9-AS1是通過調控miR-152-3p表達進而影響肺癌細胞順鉑敏感性，將si-KIF9-AS1分別與anti-miR-NC、anti-miR-152-3p共轉染A549/DDP細胞，依次記為anti-miR-NC+si-KIF9-AS1組、anti-miR-152-3p+si-KIF9-AS1組。6 h后，更換新鮮含血清培養液，繼續培養48 h，胰酶消化收集細胞進行后續實驗。

1.2.4 CCK-8法檢測細胞活力:將A549/DDP細胞接種在96孔板，按照實驗分組轉染48 h后，將10 μl的CCK-8溶液添加到每個孔中，孵育2 h后，酶標儀測量450 nm處的光密度(OD)值。收獲各轉染組A549/DDP細胞并將其接種在96孔板，用不同濃度的順鉑(5、10、20、40、80 μmol/L)處理48 h。按照CCK-8使用說明使用檢測OD450 nm值。根據OD值計算半數抑制濃度(IC50)。

1.2.5 流式細胞術檢測細胞凋亡:收獲各轉染組A549/DDP細胞，結合緩沖液調整為1×106/ml的單細胞懸液。取100 μl細胞懸液，加入5 μl的Annexin-V-FITC和PI室溫避光染色15 min。添加400 μl結合緩沖液后，流式細胞術分析細胞凋亡情況。

1.2.6 蛋白質印記(Western blot)檢測CyclinD1、Cleaved-caspase-3和MRP1蛋白表達:采用含有蛋白酶抑制劑的RIPA緩沖液在冰上孵育各組細胞30 min，4℃離心機10 000 r/min離心15 min獲得細胞總蛋白。二喹啉甲酸法測量蛋白濃度后，100℃煮3 min使細胞蛋白變性。聚丙烯酰胺凝膠電泳分離細胞蛋白后，濕法轉膜儀轉移至聚偏二氟乙烯膜。用5%脫脂奶粉封閉膜后，用CyclinD1、Cleaved-caspase-3和MRP1抗體4℃孵育膜12 h，隨后用稀釋的二抗室溫下與膜反應2 h。顯色后，Quantity One軟件對目的條帶灰度值進行量化分析。

1.2.7 雙熒光素酶報告基因實驗:將含有miR-152-3p結合位點的KIF9-AS1野生型(WT)序列或突變型(MUT)序列分別插入到pGL3載體構建雙熒光素酶報告基因載體。利用LipofectamineTM2000試劑將WT-KIF9-AS1、MUT-KIF9-AS1與miR-152-3p mimics或miR-NC分別共轉染A549/DDP細胞，共轉染48 h后，熒光素酶測定系統檢測熒光素酶活性。

2 結果

2.1 在肺癌耐藥細胞A549/DDP中KIF9-AS1、miR-152-3p、MRP1表達情況 與A549親本細胞比較，耐藥細胞A549/DDP中KIF9-AS1表達水平顯著升高，miR-152-3p表達顯著降低，MRP1蛋白表達顯著升高(P<0.05)。見表1，圖1。

圖1 Western Blot 檢測MRP1蛋白的表達量

表1 在肺癌耐藥細胞A549/DDP中KIF9-AS1、miR-152-3p、MRP1表達情況

2.2 下調KIF9-AS1表達抑制A549/DDP細胞增殖，促進凋亡，降低對順鉑的耐藥性 與si-NC組比較，si-KIF9-AS1組A549/DDP細胞KIF9-AS1表達顯著降低，細胞活力和CyclinD1蛋白表達顯著降低，凋亡率和Cleaved-caspase-3蛋白表達顯著升高，對順鉑的IC50、MRP1蛋白表達顯著降低(P<0.05)。見表2，圖2。

表2 下調KIF9-AS1表達對A549/DDP細胞增殖、凋亡和順鉑耐藥性的影響

圖2 下調KIF9-AS1表達對A549/DDP細胞增殖、凋亡和順鉑耐藥性的影響;A 流式細胞儀檢測細胞凋亡;B Western Blot檢測CyclinD1、Cleaved-caspase-3和MRP1蛋白的表達

2.3 上調miR-152-3p表達抑制A549/DDP細胞增殖，促進凋亡，降低對順鉑的耐藥性 與miR-NC組比較，miR-152-3p組A549/DDP細胞miR-152-3p表達顯著升高，細胞活力和CyclinD1蛋白表達顯著降低，凋亡率和Cleaved-caspase-3蛋白表達顯著升高，對順鉑的IC50、MRP1蛋白表達顯著降低，差異有統計學意義(P<0.05)。見表3，圖3。

圖3 Western Blot檢測CyclinD1、Cleaved-caspase-3和MRP1蛋白的表達

表3 上調miR-152-3p表達對A549/DDP細胞增殖、凋亡和順鉑耐藥性的影響

2.4 KIF9-AS1靶向調控miR-152-3p表達 Starbase在線預測顯示見圖4，KIF9-AS1與miR-152-3p之間存在結合位點。雙熒光素酶活性檢測顯示，與miR-NC和WT-KIF9-AS1共轉染比較，miR-152-3p和WT-KIF9-AS1共轉染后A549/DDP細胞相對熒光素酶活性顯著降低(P<0.05)；與miR-NC和MUT-KIF9-AS1共轉染比較，miR-152-3p和MUT-KIF9-AS1共轉染后A549/DDP細胞相對熒光素酶活性無顯著變化。RT-qPCR檢測顯示，pcDNA-KIF9-AS1組A549/DDP細胞miR-152-3p的表達水平較pcDNA-NC組顯著降低(P<0.05)；si-KIF9-AS1組A549/DDP細胞miR-152-3p的表達水平較si-NC組顯著升高(P<0.05)。見表4、5，圖4。

表4 miR-NC或miR-152-3p與報告質粒共轉染A549/DDP細胞后雙熒光素酶活性檢測

表5 RT-qPCR檢測miR-152-3p的表達

圖4 通過starbase對miR-152-3p和KIF9-AS1結合區域進行預測

2.5 下調miR-152-3p表達可逆轉KIF9-AS1下調對A549/DDP細胞增殖、凋亡和順鉑耐藥性的影響 與anti-miR-NC+si-KIF9-AS1組比較，anti-miR-152-3p+si-KIF9-AS1組A549/DDP細胞miR-152-3p表達顯著降低，細胞活力和CyclinD1蛋白表達顯著升高，凋亡率和Cleaved-caspase-3蛋白表達顯著降低，對順鉑的IC50、MRP1蛋白表達顯著升高(P<0.05)。見圖5，表6。

表6 下調miR-152-3p表達可逆轉KIF9-AS1下調對A549/DDP細胞增殖、凋亡和順鉑耐藥性的影響

圖5 Western Blot檢測CyclinD1、Cleaved-caspase-3和MRP1蛋白的表達

3 討論

肺癌仍然是最常見的人類惡性腫瘤，是全球范圍內癌癥死亡的首要原因[5]。順鉑化療已是外科手術切除后肺癌的一線輔助治療和晚期肺癌患者的重要治療手段[6]。然而，隨著肺癌的發展，癌細胞對順鉑的敏感性減弱導致順鉑耐藥和化療失敗。近年來，多項研究表明LncRNA在腫瘤耐藥中發揮重要作用。Ge等[7]研究發現LncRNA FOXD2反義RNA1(FOXD2-AS1)通過調控miR185-5p/同源盒蛋白1(SIX1)分子軸促進肺癌進展和順鉑耐藥。Tian等[8]證實在順鉑耐藥肺癌患者和小鼠A549/DDP異種移植瘤組織中LncRNA X染色體失活特異轉錄物(XIST)表達上調，下調XIST表達可降低細胞的存活率、增殖和遷移能力，誘導細胞凋亡，并抑制耐藥蛋白表達。為探討KIF9-AS1在肺癌順鉑耐藥中的作用，本研究首先檢測A549和A549/DDP細胞中KIF9-AS1表達，結果顯示A549/DDP細胞中KIF9-AS1表達顯著升高。通過轉染si-KIF9-AS1下調KIF9-AS1表達可降低A549/DDP細胞活力和對順鉑的IC50值，提高細胞凋亡率，降低促增殖蛋白CyclinD1和耐藥蛋白MRP1的表達水平，升高促凋亡蛋白Cleaved-caspase-3的表達水平。以上結果表明，KIF9-AS1可促進肺癌的順鉑耐藥。

LncRNA充當miRNA海綿抑制miRNA活性進而參與腫瘤耐藥的機制已被廣泛報道。例如，LncRNA肺腺癌轉移相關轉錄本1(MALAT1)通過吸附miR-200a促進肺癌細胞的增殖和吉非替尼耐藥[9]；LncRNA TTN反義RNA1(TTN-AS1)通過靶向miR-134-5p參與調節骨肉瘤細胞生長、凋亡和耐藥性[10]。為探討KIF9-AS1的可能作用機制，本研究通過Starbase在線分析發現miR-152-3p與KIF9-AS1之間存在相互作用。既往研究表明，miR-152-3p在肺癌、乳腺癌、膠質瘤等多種實體瘤中表達下調發揮抑癌基因作用，上調miR-152-3p表達可抑制腫瘤細胞的生長和轉移[11-13]。此外，miR-152-3p低表達與卵巢癌、膠質瘤的順鉑耐藥有關，上調miR-152-3p表達可提高其順鉑敏感性[14,15]。本研究發現A549/DDP細胞中miR-152-3p表達顯著降低，提示miR-152-3p表達下調可能與肺癌順鉑耐藥有關。通過轉染miR-152-3p mimics上調miR-152-3p表達可降低A549/DDP細胞活力和對順鉑的IC50值，提高細胞凋亡率，降低CyclinD1和MRP1蛋白表達水平，升高Cleaved-caspase-3蛋白表達水平，與Zhang等[11]miR-152-3p在肺癌中發揮抑癌作用結論基本吻合。進一步研究顯示，miR-152-3p是KIF9-AS1的靶基因，且KIF9-AS1對miR-152-3p具有負性調控作用。此外，下調miR-152-3p表達還可部分逆轉下調KIF9-AS1對A549/DDP細胞活力、凋亡、順鉑耐藥以及相關蛋白表達的影響，這進一步說明KIF9-AS1通過靶向miR-152-3p促進肺癌順鉑耐藥形成。

綜上所述，lncRNA KIF9-AS1在肺癌順鉑耐藥中發揮促進作用，下調KIF9-AS1表達可抑制A549/DDP細胞增殖，促進細胞凋亡，增強其對順鉑的敏感性，其機制與靶向調控miR-152-3p表達有關。因此，lncRNA KIF9-AS1/miR-152-3p有望成為克服肺癌順鉑耐藥的有效靶點。