阿托伐他汀對急性肺栓塞大鼠SIRT2/NF-κB通路及動脈血氣指標的影響

梁蔚繁 李朝鋒

急性肺栓塞(acute pulmonary embolism，APE)是呼吸科常見的疾病，由外源性或內源性血栓堵塞肺血管引起，起病隱匿，早期難以及時診斷，病情發展迅速，且致死、致殘率較高[1,2]。APE后的肺血循環障礙可導致患者肺組織缺血、缺氧，引發嚴重的炎性反應，使得肺組織發生充血水腫，破壞肺部換氣功能，造成肺功能障礙[2,3]。SIRT2/NF-κB是機體調控炎性反應的重要信號通路，APE引起的肺組織缺血、缺氧可下調SIRT2表達，抑制NF-κB蛋白去乙酰化，促使其向核內轉移，激活促炎因子表達，引發炎癥并加快其進展；激活SIRT2信號，可增強NF-κB的去乙?；种破浜艘莆?，進而阻止炎癥的發生發展，改善APE誘導的肺動脈高壓、低氧血癥和肺功能衰竭癥狀[4-6]，表明SIRT2/NF-κB是治療APE的作用靶點。阿托伐他汀是一類他汀類藥物，具有抗炎、降低膽固醇、改善心血管功能的作用，能顯著抑制冠狀動脈微栓塞導致的心肌炎性反應，減輕心肌損傷，改善心功能，還可降低APE患者肺動脈平均壓，抑制肺血管重構，改善其臨床癥狀[7,8]。但阿托伐他汀對APE大鼠SIRT2/NF-κB通路及動脈血氣指標的影響目前還未見明確闡釋，本文通過建立APE大鼠模型，對此進行探討。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物:清潔級SD大鼠，無錫珊瑚礁生物科技有限公司，許可證號為SCXK(蘇)2017-0009，雄性，體重200～240 g。在本院動物房中飼養，溫度25℃，相對濕度50%，12 h/12 h交替照明，保證室內環境達到清潔級，且安靜、通風良好，具體按照《關于善待實驗動物的指導性意見》進行飼養，1周后進行實驗。

1.1.2 試劑與儀器:速碧林(低分子肝素鈣注射液，規格0.6 ml)，葛蘭素史克有限公司；阿托伐他汀鈣片(規格10 mg)，輝瑞制藥有限公司；大鼠IL-18 ELISA試劑盒、大鼠IL-6 ELISA試劑盒、兔源Anti-GAPDH、Anti-SIRT2、Anti-NF-κB、Anti-PCNA一抗、羊抗兔二抗—貨號ab206386、ab100772、ab100768、ab115681、ab38515、ab18197、ab86299，美國Abcam公司；HE染色試劑盒—貨號RS3390，北京金克隆生物技術有限公司；BCA試劑盒、蛋白裂解液—貨號P0011、P0013B，上海碧云天公司等。DHX-300動物呼吸機：成都儀器廠，中國；ABL80血氣分析儀：雷度米特公司，丹麥；2.7F微導管：泰爾茂株式會社，日本；YP100壓力換能器：上海益聯醫學儀器發展有限公司，中國；PowerLab多導生理記錄儀：上海然哲儀器設備有限公司，中國；Elx800酶標儀、1658033小型蛋白垂直電泳轉印系統：Bio-Rad公司，美國；RM2035輪轉切片機：Leica公司，德國；SMZ745光學顯微鏡：尼康公司，日本；GelSMART凝膠成像儀：北京大龍興創實驗儀器有限公司，中國。

1.2 方法

1.2.1 大鼠模型制備及分組給藥:參照文獻[9]制備APE大鼠模型：經SD大鼠尾靜脈取血約1 ml，靜置使其凝固，置于70℃水浴鍋內，加熱10 min后，倒入平皿中，將凝固的血液切為小血栓顆粒，直徑約0.5 mm，以2.5%戊巴比妥鈉溶液腹腔注射，麻醉大鼠，劑量為45 mg/kg，頸部備皮、消毒，分離右頸靜脈，以5 ml注射器吸取剪好的血栓27～30個及1 ml 0.9%氯化鈉溶液，排除氣泡后，刺入頸靜脈，循靜脈回流方向緩慢推注血栓，用時約5 min，然后縫合傷口，消毒，4 h后，采用改良右心導管法測量大鼠肺動脈平均壓(mean pulmonary arterial pressure，mPAP)和右心室壓力(right ventricular pressure，RVP)，當其明顯升高，且大鼠呼吸加深加快、兩肺出現彌漫性干濕啰音等癥狀時，表明建模成功。共建模64只，成功60只，隨機分為假手術組、阿托伐他汀低劑量組(1 mg/kg)、阿托伐他汀中劑量組(2 mg/kg)、阿托伐他汀高劑量組(4 mg/kg)、速碧林組(0.01 ml/kg)，每組12只，另取12只SD大鼠分離右頸靜脈后不輸注血栓，只輸入1 ml 0.9%氯化鈉溶液，其他操作相同，設定為假手術組。參照文獻，以0.9%氯化鈉溶液溶解阿托伐他汀鈣片[10]，制備為0.1、0.2、0.4 mg/ml的溶液，阿托伐他汀各劑量組以10 ml/kg的劑量灌胃，速碧林組以0.01 ml/kg的劑量皮下注射低分子肝素鈣注射液[11]，假手術組及模型組大鼠皮下注射等劑量0.9%氯化鈉溶液，同時以10 ml/kg 的劑量灌胃，1次/d，持續14 d。

1.2.2 大鼠mPAP和RVP測定:末次給藥結束24 h后，將2.7F微導管經肺動脈、右心房插入右心室，連接壓力換能器，測定大鼠mPAP和RVP。

1.2.3 標本采集:大鼠mPAP、RVP測定結束后，參照1.2.1中的方法麻醉大鼠，開胸，鈍性分離氣管和股動脈，經股動脈取血2 ml備用；剪斷股動脈放血，以2 ml注射器刺入氣管下段，向其中緩慢注入1ml 0.9%氯化鈉溶液，當左肺膨隆，并變蒼白時，緩慢回抽，然后再次緩慢注入后回抽，重復3次，所得液體離心5 min(4℃，3 000 r/min)，收集上清，可得肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavagefluid，BALF)，儲存在-80℃備用；解剖取出雙肺，剪取約0.5 g肺組織，儲存于液氮中備用；其余肺組織以生理鹽水漂洗、4%多聚甲醛溶液固定、梯度乙醇溶液(由低到高)脫水、二甲苯透明、石蠟包埋后，以切片機做連續病理切片備用，厚度為5 μm。

1.2.4 大鼠動脈血氣指標測定:采用全自動血氣分析儀檢測1.2.2中的股動脈血中血氣指標：氧分壓(arterial partial pressure of oxygen，PaO2)、二氧化碳分壓(arterialpartial pressure of carbon dioxide，PaCO2)，具體操作步驟參照其說明書進行。

1.2.5 大鼠肺部病理形態檢測:選取1.2.2中完好、典型的切片，進行二甲苯脫蠟、梯度乙醇(從高到低)浸泡處理，參照試劑盒說明書的步驟進行HE染色，以蒸餾水漂洗后，再次脫水、透明，采用中性樹膠封片，使用光學顯微鏡觀察大鼠肺部病理形態，每個切片隨機選取5個視野拍照。

1.2.6 大鼠BALF中IL-18、IL-6含量測定：中BALF放置在冰水浴中，緩慢解凍，參照ELISA試劑盒說明書中的操作步驟，測定其中IL-18、IL-6含量。

1.2.7 大鼠肺組織SIRT2/NF-κB通路相關蛋白表達檢測:取出1.2.2中肺組織，剪碎后置于含有1 ml蛋白裂解液的干凈試管中，以勻漿機制備為勻漿液，離心20 min(4℃，3 000 r/min)，收集上清液，得蛋白樣品液，以BCA法測定其中總蛋白濃度，具體步驟參照試劑盒說明書進行，煮沸5 min變性，各組分別取含20 μg 總蛋白的樣品液上樣，電泳分離蛋白，濕轉轉移全部分離蛋白至PVDF膜上，然后以5%的脫脂奶粉室溫孵育2 h，進行封閉處理，根據蛋白分子量截取目的蛋白條帶，放置在小盒中，做好標記，分別加入兔源Anti-GAPDH、Anti-SIRT2、Anti-NF-κB、Anti-PCNA一抗溶液，稀釋比例分別為1∶1 000、1∶2 000、1∶2 000、1∶2 000，4℃冰箱中孵育過夜，TBST漂洗3次，加入羊抗兔二抗溶液，稀釋比例為1∶2 000，室溫孵育2 h，TBST再次漂洗3次，以增強化學發光法顯色，使用凝膠成像儀對蛋白條帶拍照，以Image-J軟件分析圖像，獲得各組蛋白相對表達量。

2 結果

2.1 阿托伐他汀對大鼠mPAP和RVP的影響 與假手術組相比，模型組大鼠mPAP、RVP明顯增高(P<0.05)；與模型組相比，阿托伐他汀低、中、高劑量組及速碧林組大鼠mPAP、RVP降低(P<0.05)，且阿托伐他汀各組之間呈劑量依賴性(P<0.05)；阿托伐他汀高劑量組與速碧林組相比，大鼠mPAP、RVP差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 6組大鼠mPAP、RVP比較

2.2 阿托伐他汀處理對大鼠動脈血氣相關指標的影響 與假手術組相比，模型組大鼠PaCO2明顯增高(P<0.05)，PaO2明顯降低(P<0.05)；與模型組相比，阿托伐他汀低、中、高劑量組及速碧林組大鼠PaCO2降低(P<0.05)，PaO2增高(P<0.05)，且阿托伐他汀各組之間呈劑量依賴性(P<0.05)；阿托伐他汀高劑量組與速碧林組相比，大鼠PaCO2、PaO2差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 6組大鼠動脈血氣相關指標比較

2.3 阿托伐他汀對大鼠肺組織病理形態的影響 假手術組肺泡結構完整清晰，肺泡間隔未見炎癥細胞浸潤，肺血管結構正常；模型組大鼠肺組織呈現肺泡結構損環，間隔充血水腫，炎性細胞浸潤明顯，肺血管管腔變窄，動脈內膜明顯增生等病理損傷，阿托伐他汀低、中、高劑量組及速碧林組大鼠上述肺組織病理損傷減輕，且病理損傷隨阿托伐他汀劑量升高而逐次減輕；阿托伐他汀高劑量組與速碧林組相比，大鼠肺組織病理損傷程度無明顯差異。見圖1。

2.4 阿托伐他汀對大鼠肺BALF中IL-18、IL-6水平的影響 與假手術組相比，模型組大鼠肺BALF中IL-18、IL-6水平明顯增高，差異有統計學意義(P<0.05)；與模型組相比，阿托伐他汀低、中、高劑量組及速碧林組大鼠肺BALF中IL-18、IL-6水平降低，差異有統計學意義(P<0.05)，且阿托伐他汀各組之間呈劑量依賴性(P<0.05)；阿托伐他汀高劑量組與速碧林組相比，大鼠肺BALF中IL-18、IL-6水平差異無統計學意義(P>0.05)。見表3。

2.5 阿托伐他汀對大鼠肺組織SIRT2/NF-κB通路相關蛋白表達的影響 與假手術組相比，模型組大鼠肺組織SIRT2/NF-κB通路相關蛋白SIRT2表達水平明顯降低(P<0.05)，核內NF-κB表達水平明顯增高(P<0.05)；與模型組相比，阿托伐他汀低、中、高劑量組及速碧林組大鼠肺組織SIRT2/NF-κB通路相關蛋白SIRT2表達水平增高(P<0.05)，核內NF-κB表達水平降低(P<0.05)，且阿托伐他汀各組之間呈劑量依賴性(P<0.05)；阿托伐他汀高劑量組與速碧林組相比，各蛋白表達差異無統計學意義(P>0.05)。見表4，圖2。

圖2 免疫印跡檢測各組大鼠肺組織SIRT2/NF-κB通路相關蛋白表達;A 假手術組；B 模型組；C 阿托伐他汀低劑量組；D 阿托伐他汀中劑量組；E 阿托伐他汀高劑量組；F 速碧林組

表4 6組大鼠肺組織SIRT2/NF-κB通路相關蛋白相對表達

3 討論

近年來，我國APE的發病率逐年升高，嚴重危害人民群眾身心健康，因肺部血流循環障礙，APE患者可產生肺動脈高壓、肺血管內膜增生、肺不張、氣體交換障礙、低氧血癥一系列病理癥狀，其中缺血缺氧引發的肺部炎性反應是主要的致病基礎[12-14]。本文以自體血栓回輸法構建APE大鼠模型，結果顯示，建模大鼠肺組織呈現肺泡結構損環，間隔充血水腫，炎性細胞浸潤明顯，肺血管管腔變窄，動脈內膜明顯增生等病理損傷，肺部mPAP、RVP、動脈血PaCO2、BALF中IL-18及IL-6水平明顯升高，動脈血PaO2明顯降低，表明血栓回輸后，大鼠肺血管栓塞后，大鼠肺動脈壓和右心室壓力明顯升高，促炎因子IL-18、IL-6大量表達合成，引發嚴重的炎性反應，造成肺組織損傷及肺血管增生，導致肺臟換氣功能障礙，使動脈血中CO2潴留，O2減少，揭示模型建立成功。

APE常用的治療方法是溶栓、抗凝，低分子肝素能降低凝血因子Ⅹa的活性，抑制血栓形成，是治療APE的臨床常用抗凝藥物，可作為研究APE的陽性對照藥[15]。阿托伐他汀作為臨床常用的降脂藥，具有明顯的抗氧化、抗炎作用，可通過降低氧化應激水平，抑制炎性反應過程來減輕乙醇誘導的肝毒性，并可減小腦梗死體積，減輕APE導致的肺損傷，改善肺功能[8,16-18]。本文結果顯示，與模型組相比，阿托伐他汀低、中、高劑量組大鼠肺組織病理損傷減輕，大鼠mPAP、RVP、動脈血PaCO2、BALF中IL-18及IL-6水平降低，動脈血PaO2升高，且阿托伐他汀各組之間呈劑量依賴性，表明阿托伐他汀可降低促炎因子合成分泌，抑制炎性反應，降低肺動脈壓和右心室壓，減輕肺組織損傷，緩解肺血管內膜增生，改善肺臟換氣功能，進一步證實阿托伐他汀對APE具有治療作用。

SIRT2/NF-κB作為機體調節炎性反應的主要信號，在APE的發生發展過程中起到重要的調控作用。在APE的病理反應過程中，SIRT2表達受到抑制，降低NF-κB蛋白的去乙?；?，增強其向細胞核內的轉移，促使炎癥進展，加重了肺部損傷；通過上調SIRT2表達，可增強NF-κB蛋白的去乙酰化，抑制其核轉移，進而抑制炎癥的發生發展，減輕APE引發的肺損傷[4,19,20]。本文結果顯示，APE模型大鼠肺組織SIRT2蛋白表達明顯降低，核內NF-κB蛋白表達明顯升高，經阿托伐他汀治療后，大鼠肺組織SIRT2蛋白表達升高，核內NF-κB蛋白表達降低，表明SIRT2/NF-κB參與介導APE大鼠的肺組織損傷過程，阿托伐他汀可上調SIRT2表達，抑制NF-κB蛋白的核轉移，緩解肺組織損傷，改善APE大鼠的動脈血氣指標，減輕其臨床癥狀。

綜上所述，阿托伐他汀可激活SIRT2信號，降低NF-κB蛋白核轉移，阻止炎癥發生發展，降低肺動脈壓及右心室壓力，減輕肺部病理損傷，恢復肺泡正常換氣功能，提高動脈血中氧氣含量，減少CO2潴留，改善APE臨床癥狀。上調SIRT2表達，抑制NF-κB信號激活可能是阿托伐他汀治療APE的藥理機制之一，后續還需通過上調及下調SIRT2表達來進行對照驗證。