骨髓間充質干細胞結合Masquelet技術治療感染性骨缺損的臨床療效觀察

盧承印 王朋濤 張來福 張海龍 尹利軍 謝艷 王孝輝

臨床上由各種原因引起的感染性骨缺損較為常見，因其治療相當困難，給病人家庭和社會帶來巨大的負擔，是臨床上需要研究的課題之一［1］。各種治療方法修復感染性骨缺損時，均需多次手術，且此類病人軟組織條件往往較差，敏感抗生素缺乏，預后相對較差。近年來，Masquelet技術治療感染性骨缺損因其操作簡單，抗感染效果好及二期成骨愈合快，逐漸被臨床醫師青睞，但在治療過程中也存在移植骨吸收、骨不連等問題［2］。骨髓間充質干細胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）作為一類非造血干細胞，已有相關研究表明其可以向軟骨細胞、成骨細胞、肌細胞等細胞分化，具有較強的成骨潛能，是治療骨缺損最為理想的種子細胞［3-4］。基于此，我們采用BMSCs結合Masquelet 技術治療了30例感染性骨缺損病人，本研究回顧性分析這30例病人的臨床資料，探討應用BMSCs結合Masquelet技術治療感染性骨缺損的臨床療效。

資料與方法

一、納入標準與排除標準

納入標準：①病人年齡為20～65歲；②確診為感染性骨缺損病人；③病人采用BMSCs結合Masquelet技術進行治療。

排除標準：①患肢存在神經血管損傷或嚴重短縮畸形；②術前血尿糞常規、肝腎功、凝血等檢驗結果異常，或合并有較重的內科疾病者；③認知障礙或精神病史者；④隨訪資料不完整者。

二、一般資料

根據納入標準與排除標準，2016年6月至2019年1月河南省洛陽正骨醫院收治的30例感染性骨缺損病人納入本研究，其中男21 例，女9 例；年齡為20～65 歲，平均34.5 歲。缺損部位：脛骨干18 例，尺、橈骨干6 例，股骨干5 例，肱骨干1 例。骨缺損長度為3～13 cm，平均7.3 cm。車禍傷23例，機器擠壓傷4例，高處墜落傷3 例。24 例存在皮膚缺損或竇道，其中16例在第一階段手術時行皮瓣修復覆蓋創面，其余8例行一期徹底清創，負壓封閉引流技術控制感染，待條件許可后行取皮植皮修復創面。術前對傷口分泌物細菌培養結果：金黃色葡萄球菌陽性20例，陰溝桿菌陽性5例，產氣桿菌陽性1例，雙重細菌感染陽性2例，耐甲氧西林金黃色葡萄球菌陽性2例。所有病人術前均簽署知情同意書。

三、治療方法

（一）BMSCs制備

所有病人于Masquelet 技術二期手術前一天進行骨髓血采集和BMSCs 制備，具體方法為：骨髓血采集由醫生負責，通常選取髂前上棘后上方1～2 cm處作為穿刺點，此處骨面較平，容易固定，操作方便、安全。病人取仰臥位，常規消毒皮膚，戴無菌手套、鋪消毒洞巾，使用2%利多卡因作局部浸潤麻醉直至骨膜，做“品”字形多點麻醉。等待2 min左右，使骨膜得到充分的浸潤和麻醉。將骨髓穿刺針固定器固定在適當長度上，當穿刺針接觸到骨質后則左右旋轉，緩緩鉆刺骨質，當感到阻力消失，且穿刺針已固定在骨內時，表示已進入骨髓腔，用50 mL注射器抽吸2～4 mL 肝素鈉（上海上藥第一生化藥業有限公司，中國），來回抽吸幾次，潤濕注射器內部，將內栓退出1 cm，拔出針芯，接上注射器，用適當力度緩慢抽吸，抽吸過程中，拔出注射器，及時搖晃混勻，避免骨髓血凝固。抽吸完畢后，插入針芯，輕微轉動拔出穿刺針，隨后將消毒紗布蓋在針孔上，稍加按壓，用膠布加壓固定，術后壓迫止血。采集完成后由醫生交給組織工程實驗人員將血樣轉運至實驗室。采用75%醫用酒精擦拭注射器外壁后轉移至局部百級的生物安全柜（濟南鑫貝西生物技術有限公司，中國）內，將注射器內的抗凝骨髓血轉移至50 mL 無菌離心管，以600 g 離心15 min，用移液管小心將含BMSCs 的上層清液轉移至新的無菌離心管以200 g 進行二次離心，棄去上清后獲得的濃集液置于無菌注射器中，使用一次性自封包裝袋包裝備用。取0.5 mL 濃集液進行細菌培養，另取0.5 mL 濃集液進行單核細胞數量檢測，單核細胞數量即可間接反映BMSCs 數量，一般以（5～10）×105個/L 為佳。隨后使用凝血酶凍干粉200 U（湖南一格制藥有限公司，中國）與1～2 mL 生理鹽水配制成凝血酶溶液，使用5 mL注射器將其吸入注射器內，套上專用注射器堵頭，使用一次性自封包裝袋包裝。由制備人員將凝血酶溶液和BMSCs濃集液交給負責醫生。

（二）Masquelet技術手術方法

手術分兩個階段進行。第一階段：徹底清創，清除骨缺損周圍炎性組織及死骨，一期或二期皮瓣覆蓋創面，骨缺損區用抗生素骨水泥（萬古霉素）填充缺損及骨折斷端，外固定架或鋼板內固定，負壓引流管充分引流。清創后觀察創面愈合情況，如出現復發感染，需再次清除，抗生素骨水泥填充，重復上述過程。

第二階段手術：確定創面無滲出及竇道等感染征象，且連續復查2～3次血常規，C反應蛋白等感染指標正常后，進行第二階段手術。根據病人骨缺損情況去除或保留固定，沿原切口或皮瓣周邊切開，顯露形成的誘導膜，在保護誘導膜完整性前提下將骨水泥小心取出，打通髓腔。將凝血酶溶液與BMSCs濃集液在方盤內混合后靜置3～5 min 即形成凝膠樣BMSCs，在誘導膜腔內填充凝膠樣BMSCs 與自體骨或自體骨與人工骨（上海驍博科技發展有限公司，中國）的混合物，一般自體骨與人工骨比例要大于3∶1，在骨斷端骨皮質周圍充分植骨后，縫合誘導膜，充分引流，沖洗縫合傷口。術后定期復查X線片，觀察骨缺損愈合情況，如果復診時出現骨折愈合不全或不愈合，則再次取髂骨補充植骨，術后常規自體功能康復。

四、療效評價

記錄所有病人骨折愈合時間及治療過程中并發癥發生情況，并于末次隨訪時使用Johner-Wruhs 評分標準對骨缺損愈合優良率進行評價。優：骨缺損愈合，無神經血管損傷，無畸形，關節活動范圍正常，無疼痛，能夠恢復正常工作；良：骨缺損愈合，輕度神經血管損傷，輕度畸形，關節活動范圍輕度受限，有時疼痛，正常工作輕度受限；可：骨缺損愈合，中度神經血管損傷，肢體畸形，關節活動范圍中度受限，經常有局部疼痛，正常工作嚴重受限；差：骨缺損未愈合，嚴重神經血管損傷，肢體嚴重畸形，關節活動范圍嚴重受限，嚴重局部疼痛，不能正常工作。

結 果

所有病人隨訪8～25個月，平均15.5個月。其中16 例一期皮瓣均成活。所有病人骨缺損在術后平均8.3（6～15）個月獲得臨床和影像學愈合。1 例術后感染復發，重復應用誘導膜技術后愈合。1 例術后12個月時復查顯示骨折愈合不全，再次取髂骨補充植骨后愈合。末次隨訪時采用Johner-Wruhs評分標準評定：優27 例，良2 例，可1 例，優良率為96.7%。典型病例見圖1。

圖1 男，32歲，車禍致左脛骨骨折術后感染合并骨缺損 a、b：鋼板螺釘固定術后8個月脛腓骨正側位X線片顯示骨折不愈合；c、d：Masquelet技術一期手術，抗生素骨水泥填充術后正側位X線片；e、f：分離濃縮后果凍樣BMSCs標本；g、h：Masquelet技術二期手術，骨水泥取出，BMSCs與自體骨混合植骨術后6個月復查顯示骨折愈合良好；i、j：Masquelet技術二期手術后12個月顯示骨折愈合，去除鋼板內固定

討 論

2000 年Masquelet 等［5］首次報道采用誘導膜技術治療35 例4～25 cm 長管狀骨骨缺損病人，均取得成功。隨后眾多學者們開始將此技術應用于修復骨感染、骨腫瘤、創傷等各種原因造成的骨缺損［6-7］。Masquelet技術操作簡單、適應范圍廣、療效確切，同時具有較強的抗感染能力［8］。與骨移植技術相比，其優勢在于不受骨缺損長度限制，適應證更廣泛；與Ilizarov 技術相比，其優勢在于愈合時間短、并發癥少，且病人護理難度相對較低；與帶血管蒂骨移植技術相比，其手術不需要顯微外科技術，因此手術難度相對較低。隨著臨床應用增多，許多學者支持誘導膜技術重建骨缺損的臨床效果，但同時也報道其存在感染或骨折不愈合的風險［9］。感染或炎癥復發常由于創面清創不徹底及圍手術期管理不當所致，本組病例回顧分析發現術前根據細菌培養的藥敏試驗進行圍手術期用藥，待紅細胞沉降率，C反應蛋白等炎性指標接近正常是減少術后感染復發的重要環節。術中徹底清創，切除死骨、無血運骨和硬化骨，放置抗生素骨水泥，采用皮瓣等措施解決創面皮膚覆蓋是減少復發的關鍵環節。術后及時觀察及處理創面，同時應用敏感藥物是防止復發的重要保證，一旦復發，需重新進行上述過程以確保二期手術成功。本研究嚴格采用上述步驟，僅1例復發，重復上述過程后治療成功。

對于感染性骨缺損，感染控制后的另一大難題就是骨缺損的愈合，Masquelet技術的原理是通過第一階段置入抗生素骨水泥間隔物達到控制感染的目的，同時促使其誘導形成纖維膜，利用誘導膜所富含的生物活性物質環境以及適合骨生長的空間來促進植入骨存活并皮質化從而完成骨缺損的修復［10］。Nau 等［11］在96 只小鼠的對照實驗中，發現誘導膜能促進新骨形成，并且加速骨礦物質密度和骨硬度的進展。Yee等［12］也提到誘導膜能夠防止移植物再吸收并促進骨質向內生長修復缺損。但Masquelet 技術也存在骨誘導能力有限，骨質塑性相對較慢的問題［13］。如果出現植骨不充分，自體異體骨比例不當等，則容易發生骨折不愈合的情況。因此，國內外專家也一直在尋求縮短治療周期的方法，或者增強骨的修復質量，幫助病人早日擺脫疾病的困擾，恢復工作和生活。隨著人們在干細胞領域研究的不斷深入，BMSCs 逐漸開始在骨缺損修復領域被廣泛應用［14］，自體BMSCs能夠在不同的誘導因素下向軟骨細胞和成骨細胞轉化，具有良好的成骨誘導作用［15］。目前有研究表明，骨形態發生蛋白-2（bone morphogenetic protein 2，BMP-2）、轉化生長因子-β2（transforming growth factor-β2，TGF-β2）以及血管內皮細胞生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）等在促進BMSCs 成骨分化過程中具有協同和誘導作用［16］。而Toth 等［17］通過大鼠實驗研究表明Masquelet技術中的誘導膜包含各種生長因子如VEGF，TGF-β和BMP-2。因此，Masquelet 技術也能夠更好地誘導BMSCs向成骨細胞轉化，從而促進骨缺損愈合。本研究將BMSCs與Masquelet技術相結合，將分離提取的凝膠狀的自體BMSCs與自體骨、人工骨結合并填充至誘導膜內，從而在控制感染的前提下，解決骨缺損這一難題，病人骨缺損在術后平均8.3（6～15）個月獲得臨床和影像學愈合。

筆者認為BMSCs 結合Masquelet 技術治療感染性骨缺損具有以下優勢：①Masquelet技術一期手術能夠對感染進行有效控制，形成的誘導膜又能夠在二期手術植骨時誘導BMSCs 向成骨細胞轉化從而促進骨缺損愈合；②自體BMSCs 取材方便，來源廣泛，同時不存在排異反應和倫理問題；③基于BMSCs 的成骨能力，二期植骨時能夠一定程度上彌補人工骨誘導骨生成能力有限以及自體骨來源不足的問題，促進骨缺損修復。

本研究存在以下局限性：①由于老年人體內BMSCs 活力及分化成骨細胞能力相對較差，因此本次研究未納入年齡超過65歲以上病人；②BMSCs技術經濟成本相對較高，對于經濟狀況一般的病人可能無法接受；③本次研究納入病例數量有限，且因骨缺損部位不同，設置單純Masquelet技術對照組無法做到基線資料可比，因此對于BMSCs能否促進Masquelet 技術治療的骨缺損愈合，無法得到具有統計學意義的數據，未來隨著樣本數量的提升，我們也將對兩種方法的療效進行對照比較，以得出更具臨床意義的研究結果；④對于骨髓血采集量的問題，目前臨床上尚無統一標準，BMSCs 的濃度對療效產生的影響仍有待進一步研究；⑤BMSCs 的提取、鑒定以及保存等方面對實驗室條件要求較高，基層醫院開展該技術受到一定程度的限制。

在治療過程中，有以下事項需要注意：①實驗室提供的生物活性濃集物終產品是無菌的，但是其外包裝不能保證運輸等過程的無菌，因此不能直接將外包裝放在無菌手術臺上，需要護士協助醫生打開離心管，醫生若接觸上述外包裝表面后，需要更換新手套后，方可繼續手術操作。②由于此方法病人需進行包括骨髓血采集在內的多次手術治療，病人再次感染的風險較高，因此在整個治療過程中都需要特別注意；③Masquelet 技術二期手術時應當選擇合適的固定方式，包括髓內針、鋼板內固定等，如骨缺損較大或骨折不穩定者，建議選擇外固定架進行固定。

綜上所述，我們認為，采用BMSCs 結合Masquelet誘導膜技術治療感染性骨缺損效果良好，是一種可行的治療方法。