微濾膜分離技術在疾控中心微生物檢驗中的應用價值分析

包 蕾，馬惘卿，朱學存，陳 娟（通訊作者）

（云南省玉溪市疾病預防控制中心 云南 玉溪 653100）

微生物檢驗是疾控中心日常工作中極其重要的一部分內容，在傳統的微生物檢驗中，平板培養檢驗法常用，但是此種檢驗方式耗時比較長，靈敏度較低，尤其對微生物的檢出率比較低，導致檢驗效果達不到預期。近年來，隨著我國微生物檢驗技術的不斷發展，微生物檢驗設備的不斷升級，微濾膜分離技術逐漸取代了傳統的平板培養檢驗法[1]。微濾膜分離技術中的微濾膜是一種多孔薄膜，此種材料目前已經被廣泛的應用在了多個領域，比如食品檢驗、污水處理、工業廢水處理、環境衛生監測等領域，在醫療衛生領域中的運用效果受到了患者及醫務工作者的高度認可。本次研究隨機選取了在我疾控中心進行待檢的40份微生物樣本，通過比較不同的檢驗方式得到的檢驗結果，詳細的分析了微濾膜分離技術的應用優勢。現報道如下。

1.資料與方法

1.1 一般資料

2018年5月—2020年12月，從我疾控中心接收的食品微生物待檢樣本中隨機選取40份生禽肉樣本作為研究對象。納入標準：（1）均來自于工作中；（2）樣本合格。排除標準：（1）樣本質量不合格。根據檢驗方式的不同，將40份生禽肉樣本為觀察組和對照組，對照組實施常規平板培養、觀察組實施微濾膜分離技術平板培養，每組有樣本20份。兩組標本一般信息差異無統計學意義（P＞0.05）。

1.2 方法

對照組實施常規平板培養檢驗。檢驗人員取分割禽肉適量放入無菌自封袋中，加入緩沖蛋白胨水（以每1 kg樣品加入500 mL緩沖蛋白胨水的比例）,以100 r/min的速度震蕩15 min，無菌操作取出肉塊，漂洗液作為原液進行檢測。吸取3 mL于100 mL Bolton肉湯中，微需氧條件下，（36±1）℃進行增菌培養24～48 h。將24 h增菌液、48 h增菌液及對應的1:50稀釋液分別劃線接種于Skirrow血瓊脂與哥倫比亞血瓊脂平板上，微需氧條件下42±1 ℃培養24～48 h。觀察24 h培養與48 h培養的瓊脂平板上的菌落形態，Skirrow血瓊脂平板上的第一型可疑菌落為灰色、扁平、濕潤有光澤，呈沿接種線向外擴散的傾向；第二型可疑菌落常呈分散凸起的單個菌落，邊緣整齊、發亮為可疑菌落。挑取5個（如少于5個則全部挑取）或更多的可疑菌落接種到哥倫比亞血瓊脂平板上，微需氧條件下42±1 ℃培養24～48 h。取純培養細菌做氧化酶試驗、過氧化氫酶試驗、馬尿酸鹽水解試驗和呵哚乙酸酯水解試驗（儀器：梅里埃VITEK Compact 30全自動微生物生化鑒定儀）四個生化試驗進行初步鑒定。經生化試驗初步鑒定為空腸彎曲菌的細菌，需送上級部門進行PCR鑒定復核。

觀察組微濾膜分離技術檢驗。檢驗人員采用微濾膜作為檢驗載體，首先取分割禽肉一塊（25 g以上）放入無菌自封袋中，加入BPW培養液將樣本充分的淹沒，置于振蕩器上震蕩15 min（100 r/min），在無菌的環境下取出肉塊，將漂洗液用于后續檢測。取2 mL的漂洗液加入到4 mL彎曲菌增菌培養液中，充分混勻，置于微需氧環境下（5% O2、10% CO2和85% N2），不同培養溫度增菌24 h用于檢測。選擇帶濾膜的Karmali培養基和哥倫比亞血瓊脂（生產企業：青島中創生物科技有限公司），在無菌的環境下，將濾膜輕輕貼在平板的中央表面，將有網格的一面向上，貼的時候不能產生氣泡，取250 μL樣板懸液分成5～7點滴在濾膜上，置于37 ℃的環境下擱置1 h，取掉濾膜，在37 ℃的環境下培養48 h。對菌落形態進行測定時，初次分離培養2～3 d，如果菌落不溶血，呈現為扁平、濕潤、有光澤、邊緣完整、顏色發亮，培養5～6 d后菌落體積增大、顏色灰白、呈現為扁平形態，但是菌落不溶血。取雙孔板濾膜印跡內3～4個疑似菌落，進行涂板于接種哥倫比亞血瓊脂平板上（無須劃線培養，直接挑取單菌落），置于需氧環境中純化培養24～48 h。取純培養細菌做氧化酶試驗、過氧化氫酶試驗、馬尿酸鹽水解試驗和呵哚乙酸酯水解試驗（儀器：梅里埃VITEK Compact30全自動微生物生化鑒定儀）4個生化試驗進行初步鑒定。經生化試驗初步鑒定為空腸彎曲菌的細菌，需送上級部門進行PCR鑒定復核。

1.3 觀察指標

統計兩組空腸彎曲菌檢出率，計算樣本檢測中受到雜菌干擾的污染率，在兩組結果進行統計學比較。

1.4 統計學方法

采用SPSS 20.0統計軟件進行數據處理。正態分布的計量資料采用均數±標準差（±s）表示，組間比較采用t檢驗；計數資料用頻數和百分率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2.結果

觀察組微生物檢出率高于對照組（P＞0.05），樣本雜菌污染率低于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05），見表1。

表1 兩組檢驗結果比較[n（%）]

3.討論

微濾膜分離技術是近年來被廣泛應用于臨床微生物檢驗中的一種新型檢驗技術[2]。采用此種技術對標本中的微生物進行檢驗時，可以將通過物質之間的靜壓，將其作為一種推動力，如果物質的直徑比濾膜孔徑大，則可以充分的采用微濾膜分離技術通過半透膜分析法對這些直徑比較大的物質進行相應的截留，進一步有效的清除這些氣相和液相物質中所存在的一些固體物質還有微生物和一些膠體物質，實現氣相物質中、液相物質的凈化，達到有效分離微生物的檢驗目標[3]。經過上述分析后發現，采用微濾膜分離技術進行微生物檢驗的過程中，微濾膜發揮著極其重要的作用，一般情況下，所采用的微濾膜實際上是一種薄膜，其厚度較薄的為100 μm，較厚的為150 μm，不管微濾膜的厚度屬于哪種，其結構上都會均勻的分布多個小孔，這些小孔的作用就是要對粒徑在0.02～10 μm的微生物、氣相物質中的固體物質、液相中的固體物質等進行過濾[4]。

目前，被廣泛應用于實驗室中的微濾膜主要為有機微濾膜和無機微濾膜兩種，有纖維素酯類、聚丙烯等材料制成的微濾膜屬于有機微濾膜，而由玻璃、沸石、金屬等氧化物材料所制成的微濾膜則屬于無機微濾膜[5]。隨著研究的逐步深入，有越來越多的研究人員發現，對樣本中的微生物成份進行檢驗時，與傳統的平板分離技術相比較而言，微濾膜分離技術對微生物的陽性檢出率以及檢測的靈敏度更高，并且在檢測時間上更短，在很大程度上避免了樣本在培養期間受到其他因素的影響而發生交叉污染的概率[6]。除此之外，微濾膜分離技術對待檢樣本的要求比較低，只要求待檢樣本可溶解就可進行檢驗，并且還能夠根據具體的情況，當待檢樣本能夠進行過濾就可進行檢測[7]。

本文結果顯示，在微生物檢出率方面，觀察組高于對照組，差異無統計學意義（P＞0.05），進一步提示，采用微濾膜分離技術進行微生物檢測，對微生物的檢測陽性率更高，應用價值更高。本文結果還顯示，在樣本污染率方面，觀察組低于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05），與牟玉[8]結果一致，進一步提示微濾膜分離技術實施微生物檢驗的過程中，樣本受到污染的概率更低，檢驗準確率得到了保障。

綜上所述，疾控中心檢驗人員實施微生物檢驗時，采用微濾膜分離技術，微生物檢出率更高，樣本受到雜菌污染的風險較低，可將其在更多的食品檢測上應用。但本次觀察例數較少，還需今后加大樣本量進一步繼續觀察。