模擬酸雨脅迫對(duì)黑果枸杞種子萌發(fā)特性的影響

聶必林，呂海英，如馬南木·尼合買(mǎi)提，賽比熱尼沙木·莫爾扎提

（1新疆師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，烏魯木齊830054；2干旱區(qū)植物逆境生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊830054；3新疆特殊環(huán)境物種保護(hù)與調(diào)控生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊830054）

0 引言

酸雨在科學(xué)上稱(chēng)為酸沉降，通常是指pH＜5.6的降水[1,2]。酸雨是由雨、雪等在形成和降落過(guò)程中，溶解了大氣中的硫化物，氮氧化合物等物質(zhì)，形成的pH＜5.6酸性降水[3]。近200年來(lái)，隨著工業(yè)化進(jìn)程的加快，排放在空氣中的二氧化硫、氮氧化合物等物質(zhì)激增，導(dǎo)致酸雨在全球范圍內(nèi)的分布越來(lái)越廣，酸雨污染問(wèn)題逐漸成為了全球性的重要環(huán)境污染問(wèn)題之一[4-6]。中國(guó)已經(jīng)成為繼北美洲和歐洲的全球第三大酸雨覆蓋區(qū)[7-8]，其發(fā)生面積超過(guò)了中國(guó)國(guó)土面積的40%[9-10]。針對(duì)國(guó)內(nèi)酸雨?duì)顩r學(xué)者們做了大量研究，張新民[1]等研究認(rèn)為，國(guó)內(nèi)酸雨區(qū)主要分布于華北地區(qū)、東北地區(qū)東南部、西南和華南沿海地區(qū)以及新疆北部地區(qū)；劉新春[11]等研究認(rèn)為，新疆南疆城市的酸雨遠(yuǎn)少于北疆城市，且北疆城市的酸雨pH平均值有逐年緩慢降低的趨勢(shì)；任泉[12]和劉亞民[13]等研究發(fā)現(xiàn)，烏魯木齊大氣降水的酸雨頻率為5.8%，每年的1～3月酸雨污染最為嚴(yán)重。酸雨通過(guò)改變土壤理化環(huán)境影響植株生長(zhǎng)或通過(guò)淋溶等方式直接損害植物的葉、花、果實(shí)等器官以及抑制種子萌發(fā)[14]。而種子萌發(fā)期是植物生活史中對(duì)外界環(huán)境刺激最為敏感的階段[15]，直接決定了植株能否正常生長(zhǎng)，因此，探究種子萌發(fā)對(duì)酸雨脅迫的響應(yīng)至關(guān)重要。

黑果枸杞(Lycium ruthenicum)是一種多年生的茄科(Solanceae)枸杞屬(Lycium)多刺灌木植物[16-17]，是國(guó)內(nèi)西北地區(qū)極其重要的經(jīng)濟(jì)植物，具有極高的藥用價(jià)值[18]和生態(tài)學(xué)價(jià)值，這些優(yōu)良醫(yī)藥價(jià)值主要源于其果實(shí)內(nèi)含有像多酚、類(lèi)黃酮等多種生物活性物質(zhì)[19]，多酚類(lèi)物質(zhì)具有清除體內(nèi)自由基、抗機(jī)體衰老等特性[20]，類(lèi)黃酮如原花青素和花色苷具有降血脂、抗氧化、抗突變、抗炎、提高機(jī)體免疫力等多種生物學(xué)活性[21-24]；生態(tài)學(xué)價(jià)值體現(xiàn)于黑果枸杞植株具有抗寒、抗旱、耐土壤貧瘠、耐鹽堿等生物學(xué)功能，常作為荒漠干旱區(qū)治理鹽堿地土壤、防風(fēng)固沙、保持水土的優(yōu)選樹(shù)種[25-26]。國(guó)內(nèi)外對(duì)黑果枸杞的研究多集中于其果實(shí)的藥理分析和化學(xué)成分分析，對(duì)黑果枸杞資源種植的研究相對(duì)較少。筆者以黑果枸杞種子為材料，探究不同pH的模擬酸雨對(duì)黑果枸杞種子萌發(fā)的影響，旨在為黑果枸杞播種育苗提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 供試材料 供試黑果枸杞種子于2019年9月采自新疆庫(kù)爾勒市哈拉玉宮鄉(xiāng)，為多年生人工種植。種子采集后人工去除果肉，漂洗干凈并自然風(fēng)干后保存于5℃冰箱中備用。

1.1.2 模擬酸雨配置 將濃硫酸與濃硝酸按摩爾比5:1的比例配制成pH 1.0的酸溶液作為母液，然后取適量母液，用蒸餾水分別稀釋成pH 2.0、3.0、4.0、5.0的模擬酸雨溶液，以不添加任何酸溶液的蒸餾水處理作為對(duì)照(CK，pH 6.5)，并用PHS-3C精密酸度計(jì)進(jìn)行校準(zhǔn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

實(shí)驗(yàn)于2019年11月25日在新疆師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生地樓干旱區(qū)植物逆境生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。挑選適量籽粒飽滿(mǎn)、大小均一的黑果枸杞種子，用0.5% NaClO3消毒30 min，去離子水反復(fù)沖洗3～5次，置于濾紙上晾干后，于45℃恒溫水浴鍋中催芽48 h備用。取直徑120 cm的培養(yǎng)皿25個(gè)，在每個(gè)培養(yǎng)皿中平整的鋪2層經(jīng)高溫消毒的濾紙，在濾紙上均勻擺放50粒催芽處理后的黑果枸杞種子，每皿分別施加5 mL pH 2.0、3.0、4.0、5.0的模擬酸雨溶液和pH 6.5的蒸餾水，每個(gè)處理5次重復(fù)。將全部培養(yǎng)皿置于RXZ智能型人工氣候箱（寧波江南儀器廠），設(shè)置光照強(qiáng)度2000 lx、溫度(25±1)℃、相對(duì)濕度70%、晝夜周期16 h/8 h。在萌發(fā)過(guò)程中，每3天更換一次酸脅迫處理液，期間每日利用稱(chēng)重法補(bǔ)充蒸發(fā)掉的水分，保持各處理濃度穩(wěn)定。

1.3 萌發(fā)指標(biāo)測(cè)定

從培養(yǎng)第2天開(kāi)始記錄種子萌發(fā)情況，以后每24 h記錄一次。連續(xù)7天沒(méi)有種子萌發(fā)時(shí)結(jié)束實(shí)驗(yàn)，從每個(gè)培養(yǎng)皿中隨機(jī)選取5株（不足5株的全部選擇）發(fā)芽幼苗，用蒸餾水清洗干凈并用吸水紙吸干表面水分，將胚根和胚芽分離開(kāi)，用電子天平(Mettler Toledo-AL204)稱(chēng)量出幼苗胚根鮮重，然后利用游標(biāo)卡尺測(cè)定幼苗胚根長(zhǎng)(LR)和胚芽長(zhǎng)(LG)。

根據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)計(jì)算發(fā)芽率(GP)、相對(duì)發(fā)芽率(RGP)、發(fā)芽勢(shì)(GR)、相對(duì)發(fā)芽勢(shì)(RGR)、發(fā)芽指數(shù)(GI)、相對(duì)發(fā)芽指數(shù)(RGI)、活力指數(shù)(VI)、相對(duì)活力指數(shù)(RVI)、平均發(fā)芽時(shí)間(AGT)、異狀發(fā)芽率(HGP)、相對(duì)酸害率(RADR)、胚芽比(RTGR)，計(jì)算如式(1)～(12)。

式(1)中，Ni為第i天發(fā)芽數(shù)，N為種子總數(shù)。式(5)中，Gt為第t日發(fā)芽種子數(shù)，Dt為對(duì)應(yīng)Gt的發(fā)芽天數(shù)。式(6)中，S為實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)胚根平均鮮重。式(9)中，d表示從播種之日起到種子萌發(fā)所用天數(shù)，n表示對(duì)應(yīng)各日新增發(fā)芽種子數(shù)。式(10)中，異狀發(fā)芽指長(zhǎng)出胚根而胚芽生長(zhǎng)異常或胚根及胚芽有明顯損傷的種子，表示逆境對(duì)種子萌發(fā)的傷害效應(yīng)。式(11)中，對(duì)照組正常發(fā)芽種子數(shù)是對(duì)照組發(fā)芽種子總數(shù)與對(duì)照組異狀發(fā)芽種子數(shù)的差值，實(shí)驗(yàn)組正常發(fā)芽種子數(shù)是實(shí)驗(yàn)組發(fā)芽種子總數(shù)與實(shí)驗(yàn)組異狀發(fā)芽種子數(shù)的差值。

1.4 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用Microsoft Excel 2019和SPSS 19.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 模擬酸雨對(duì)黑果枸杞種子發(fā)芽率(GP)及發(fā)芽勢(shì)(GR)的影響

GP和GR是評(píng)價(jià)種子發(fā)芽能力和種子質(zhì)量等級(jí)的重要指標(biāo)之一。結(jié)合圖1及表1分析發(fā)現(xiàn)，黑果枸杞種子的GP、GR均在pH 5最大，且GP在pH 5、pH 4時(shí)與CK(pH 6.5)差異不顯著，GR在pH 5、pH 4差異不顯著。與CK相比，pH 5時(shí)GP增加了1.08%，pH 4、pH 3、pH 2時(shí)GP分別降低了2.16%、56.76%、92.97%；pH 5、pH 4時(shí)GR分別提高了37.70%和27.87%，pH 3、pH 2時(shí)GR分別降低了44.26%和91.80%。

表1 不同pH處理下黑果枸杞種子的每日萌發(fā)率 %

RGP和RGR能夠更加直觀地反映種子發(fā)芽能力和質(zhì)量。結(jié)合圖1及表1分析發(fā)現(xiàn)，黑果枸杞種子的RGP在pH 5時(shí)高于CK，其余pH條件下均低于CK，且pH 5、pH 4時(shí)與CK差異不顯著；RGR在pH 5、pH 4時(shí)高于CK，pH 3、pH 2低于CK，各pH之間均差異顯著(P＜0.05)。綜上，輕度酸雨脅迫對(duì)黑果枸杞種子的GP、RGP、GR、RGR具有一定程度促進(jìn)效果，當(dāng)pH低于某值時(shí)產(chǎn)生抑制，抑制效果隨pH減小而增強(qiáng)。

圖1 不同pH處理下黑果枸杞種子的發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)

2.2 模擬酸雨對(duì)黑果枸杞種子發(fā)芽指數(shù)(GI)及活力指數(shù)(VI)的影響

種子的GI、RGI、VI、RVI可以用來(lái)衡量植物在一定條件下的發(fā)芽能力和活力。從圖2可以看出，黑果枸杞種子的GI和RGI隨pH減小而先升后降，均在pH 4時(shí)最大，且pH 5、pH 4差異不顯著，兩者均顯著大于CK(P＜0.05)，pH 3、pH 2顯著小于CK(P＜0.05)。黑果枸杞種子的VI和RVI在pH 5時(shí)最大，與CK差異不顯著；pH≤5時(shí)，VI及RVI均隨pH減小而降低，當(dāng)pH 2時(shí)，VI、RVI接近于零。綜上，輕度酸雨脅迫對(duì)黑果枸杞種子的發(fā)芽能力和活力有一定促進(jìn)作用，重度酸雨脅迫產(chǎn)生抑制作用，且pH越小抑制越明顯。

圖2 不同pH處理下黑果枸杞種子的發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)

2.3 模擬酸雨對(duì)黑果枸杞種子胚根長(zhǎng)(LR)和胚芽長(zhǎng)(LG)的影響

如圖3所示，隨pH減小，黑果枸杞種子的LR和LG逐漸減小，LR在pH 5時(shí)與CK(pH 6.5)差異不顯著，pH 4、pH 3、pH 2時(shí)分別顯著降低了37.09%、68.80%、81.23%(P＜0.05)；LG在pH 5、pH 4、pH 3、pH 2較CK分別降低了6.95%、64.31%、83.66%、92.97%，各pH間均差異顯著(P＜0.05)。RTGR隨pH減小逐漸增加，各pH間均差異顯著(P＜0.05)。這些結(jié)果表明酸雨脅迫對(duì)黑果枸杞種子的胚根和胚芽生長(zhǎng)具有抑制作用，酸性越強(qiáng)抑制越明顯，且對(duì)胚芽的抑制作用強(qiáng)于胚根。

2.4 模擬酸雨對(duì)黑果枸杞平均發(fā)芽時(shí)間(AGT)的影響

從表1可以看出，各pH條件下，黑果枸杞種子的發(fā)芽期在播種后的第4～12天之間，集中在第6～9天。結(jié)合圖3D分析發(fā)現(xiàn)，黑果枸杞種子的AGT隨pH減小整體上呈現(xiàn)先降后升、再降再升的趨勢(shì)。pH 5時(shí)AGT出現(xiàn)第1次極小值（7.04天），較CK顯著降低了12.61%(P＜0.05)；pH 4時(shí)AGT略有回升，但較CK顯著降低了9.38%(P＜0.05)，pH 3時(shí)AGT出現(xiàn)第2次極小值（7.10天），較CK顯著降低了11.90%(P＜0.05)；pH 2時(shí)，AGT回升明顯，較CK顯著降低了3.60%(P＜0.05)。以上說(shuō)明適度酸雨脅迫能顯著提高黑果枸杞種子的發(fā)芽速度。

圖3 不同pH處理下黑果枸杞種子的平均發(fā)芽時(shí)間和胚芽比

2.5 模擬酸雨對(duì)黑果枸杞種子異狀發(fā)芽率(HGP)和相對(duì)酸害率(RADR)的影響

由圖4A可見(jiàn)，黑果枸杞種子的HGP隨pH脅迫程度增加呈現(xiàn)明顯上升趨勢(shì)。在CK和pH 5時(shí)，黑果枸杞種子的HGP分別為3.25%和5.24%，且兩者差異不顯著；當(dāng)pH 4時(shí)，黑果枸杞種子的GP與CK沒(méi)有顯著差異，但HGP與CK差異顯著(P＜0.05)，約有半數(shù)萌發(fā)種子為異狀發(fā)芽，HGP表現(xiàn)為43.09%；當(dāng)pH 3時(shí)，黑果枸杞種子有輕微霉變，絕大多數(shù)已經(jīng)發(fā)芽的種子在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)已死亡或接近死亡，HGP達(dá)到86.08%；當(dāng)pH 2時(shí)，黑果枸杞種子全部霉變而幾乎不發(fā)芽，極少數(shù)發(fā)芽的種子也表現(xiàn)為異狀發(fā)芽，HGP高達(dá)100%。說(shuō)明不同程度酸雨脅迫均會(huì)提高黑果枸杞種子的HGP，但輕度酸雨脅迫下的HGP提升不顯著。

圖4 不同pH處理下黑果枸杞種子的相對(duì)酸害率和異狀發(fā)芽率

由圖4B分析發(fā)現(xiàn)，隨酸脅迫程度增加，黑果枸杞種子的RADR逐漸升高。pH 5時(shí)，RADR為0.78%，與CK差異不顯著；pH 4時(shí)發(fā)芽率較CK沒(méi)有顯著差異，但約有半數(shù)的發(fā)芽種子胚根被輕微灼燒，RADR約為41.95%；pH 3、pH 2時(shí)，黑果枸杞種子活性被嚴(yán)重抑制，發(fā)芽種子數(shù)量很少，即使已發(fā)芽的種子胚根也被明顯灼燒，RADR分別達(dá)93.84%和100%。

3 結(jié)論與討論

植物抗酸性的大小是一種綜合性狀的表現(xiàn)，受植物體多種因素的共同控制[27]，而種子萌發(fā)是植物生長(zhǎng)發(fā)育和接受酸雨脅迫的起點(diǎn)[28]，決定了植株能否正常建植生長(zhǎng)，因而弄清酸雨脅迫對(duì)種子萌發(fā)的影響至關(guān)重要。

本實(shí)驗(yàn)分析發(fā)現(xiàn)，不同程度的模擬酸雨脅迫對(duì)黑果枸杞種子萌發(fā)均有影響。GP、RGP、GR、RGR、GI、RGI、VI、RVI指標(biāo)在輕度(pH 5)、中度(pH 4)脅迫下與CK差異不明顯；重度(pH 3)、超重度(pH 2)脅迫下與CK具有顯著差異(P＜0.05)。這可能是因?yàn)檩p、中度模擬酸雨脅迫時(shí)，弱酸性條件促進(jìn)了種子內(nèi)部蛋白質(zhì)和淀粉的水解，或者模擬酸雨的氮、硫肥料效應(yīng)抵消了H+對(duì)種子萌發(fā)的負(fù)面影響；隨脅迫程度繼續(xù)增加，過(guò)量H+使種子的種皮透性增強(qiáng)，造成內(nèi)部離子平衡失調(diào)，自由基積累，線粒體結(jié)構(gòu)破壞，種子呼吸作用受到抑制，物質(zhì)代謝出現(xiàn)紊亂，儲(chǔ)存的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)優(yōu)先用于種子的損傷修復(fù)[29-31]，表現(xiàn)為各指標(biāo)急劇降低。LR、LG指標(biāo)隨脅迫程度增加而逐漸降低，pH 5時(shí)與CK差異不明顯，其他pH脅迫下均差異顯著(P＜0.05)，RTGR指標(biāo)隨脅迫程度增加逐漸升高，且各pH間均差異顯著(P＜0.05)，說(shuō)明模擬酸雨脅迫對(duì)黑果枸杞種子的胚根和胚芽生長(zhǎng)具有抑制作用，且對(duì)胚芽的抑制強(qiáng)于胚根。分析原因可能是根尖和芽尖細(xì)胞十分幼嫩，細(xì)胞壁沒(méi)有完全形成，環(huán)境中過(guò)量的H+使根尖細(xì)胞和芽尖細(xì)胞的細(xì)胞壁酸化，酸化后的細(xì)胞壁變得松弛，水分子通過(guò)滲透進(jìn)入細(xì)胞原生質(zhì)體，細(xì)胞因此膨脹，當(dāng)H+濃度高到一定量時(shí)，細(xì)胞過(guò)度膨脹而破裂，胚根和胚芽的生長(zhǎng)受到嚴(yán)重影響。不同程度酸雨脅迫下，AGT均顯著低于CK(P＜0.05)，在pH 5時(shí)最低，說(shuō)明酸雨脅迫能顯著縮短黑果枸杞種子的萌發(fā)時(shí)間。分析原因可能是酸性條件加速了黑果枸杞種子內(nèi)蛋白質(zhì)和淀粉等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的水解，使種子的萌發(fā)速度加快，但過(guò)高H+濃度又對(duì)種子產(chǎn)生毒害作用，發(fā)芽速度受到抑制，實(shí)際發(fā)芽速度的變化取決于促進(jìn)和抑制作用之和。這與王秀英等[32]酸雨脅迫對(duì)小麥種子萌發(fā)的研究結(jié)果并不一致，這可能與作物種類(lèi)、種子發(fā)芽實(shí)驗(yàn)方法、酸雨處理方式、酸雨離子組成及比例等有關(guān)。HGP、RADR指標(biāo)隨酸性強(qiáng)度增強(qiáng)逐漸升高，HGP在pH 5時(shí)與CK差異不顯著；RADR在各pH間均差異顯著(P＜0.05)。分析原因可能是幼苗的胚根和胚芽比種子狀態(tài)更為敏感，盡管某些耐酸性強(qiáng)的黑果枸杞種子能先長(zhǎng)出胚根（視為發(fā)芽種子），但隨脅迫程度增加，胚根被灼傷，甚至胚芽不能長(zhǎng)出或長(zhǎng)出異常，表現(xiàn)為HGP和RADR快速升高。

本研究結(jié)果表明，不同程度的酸雨脅迫對(duì)黑果枸杞種子萌發(fā)期GP、RGP、GR、RGR、GI、RGI、VI、RVI、LR、LG、RTGR、AGT、HGP、RADR指標(biāo)均有影響。其中輕度(pH 5)酸雨脅迫對(duì)萌發(fā)生長(zhǎng)影響不大，且在一定程度上縮短了種子萌發(fā)時(shí)間；中度(pH 4)酸雨脅迫對(duì)種子GP、RGP、GR、RGR、GI、RGI、VI、RVI沒(méi)有明顯影響，但HGP和RADR顯著提升；重度及以下酸雨脅迫對(duì)種子萌發(fā)均具有明顯抑制作用。因此可認(rèn)為，黑果枸杞種子對(duì)弱酸雨脅迫具有一定的耐性，適當(dāng)弱酸性環(huán)境更適合黑果枸杞種子萌發(fā)，在實(shí)際種植過(guò)程中，可利用這一特征來(lái)縮短黑果枸杞的育苗時(shí)間。當(dāng)然，除了酸度的影響外，酸雨脅迫對(duì)植株的影響還與硫素及氮素比值有關(guān)[33]，如馮麗麗等[34]研究認(rèn)為低硫氮比可能會(huì)減緩闊葉樹(shù)種香樟、木荷等的負(fù)面作用，而本實(shí)驗(yàn)只針對(duì)黑果枸杞種子萌發(fā)在硫氮比為5:1時(shí)做了初步探究，其他硫素及氮素配比對(duì)黑果枸杞種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)的影響及作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。