辣椒細菌性果實條斑病菌生物學特性及抑菌藥劑篩選

張盧慧，趙志強，趙全新，郭慶元

（新疆農業大學農學院，烏魯木齊830052）

0 引言

辣椒(Capsicum annuum)是全球第一大蔬菜，是世界上種植面積最大的蔬菜作物之一[1-2]。在世界辣椒種植的范圍內，中國在辣椒的生產與出口上均占據首位[3-4]。由于辣椒對外界環境的適應性強、品種多、種植面積大且收益多，所以辣椒的種植不僅幫助農民增收致富，同時也成為了農村發展的重要支柱產業，促進了農村經濟的發展[5]。隨著辣椒種植面積的擴大，發生在辣椒上的病害逐漸增加，嚴重制約著辣椒的品質及產量。文獻已報道的辣椒病害主要有辣椒病毒病[6]、辣椒真菌性病害[7-8]以及辣椒細菌性病害[9-10]，其中辣椒細菌性病害主要有細菌性瘡痂病、細菌性葉斑病、軟腐病、潰瘍病、青枯病[11-15]，這些病害對辣椒的生產造成了很大的影響。針對以上報道的辣椒病害，國內外研究人員對其病原鑒定、發病規律、防治方法等均進行了深入的研究[16-18]，為辣椒病害的防治起到了很好的作用。

新疆作為國內辣椒產業的一支新軍，近年來發展速度非常快[19]，2018年，筆者在新疆巴州和碩縣辣椒種植區內發現一種新的辣椒細菌性果實條斑病病害，該病害主要侵染辣椒果實、葉柄及嫩莖，以果實病斑最為顯著，葉片無明顯癥狀，發病的辣椒果實表面布有褐色的條形病斑，據調查，該病害在當地辣椒生產中發生普遍，是危害最大的病害，該病害的發病癥狀與國內外已報道的辣椒細菌性病害及辣椒條斑病毒病不同，是一種國內新發現病害。在前期的工作中，筆者對該病害的病原菌進行了鑒定，病原菌鑒定為阿根廷假單胞菌(P.argentinensis)，而關于該病害的發病規律及防治等未開展相關的研究，因此筆者針對病原菌的生物學特性及藥劑篩選開展研究，以期為田間病害規律研究和病害防治提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 從新疆巴州和碩縣辣椒種植區采集的辣椒細菌性條斑病病樣，對病樣采用組織分離、煙草過敏性反應、致病性回接測定、形態學觀察、生理生化測定、16S rDNA分子鑒定，嚴格鑒定并保存好的致病菌株阿根廷假單胞菌菌株KHL-1。

1.1.2 供試藥劑 查閱文獻上報道的細菌殺菌劑[20-22]，同時結合市場上的細菌性殺菌劑，選擇18種供試細菌殺菌劑（表1）。

表1 18種供試殺菌劑藥劑類型

1.2 辣椒細菌性條斑病病原菌生物學特性測定

1.2.1 病原菌的活化與接種液的制備 將病原菌平板劃線于NA固體培養基平板上，28℃活化培養48 h后，挑取培養基表面長出的單菌落轉接到NA培養液中，28℃、160 r/min過夜振蕩培養12 h，用紫外分光計測定菌液的OD600值，至OD600值為1.0～1.2左右時作為接種液用。

1.2.2 溫度對病原菌生長的影響 將制備好的NA培養液分裝到試管中，每個試管中分裝10 mL NA培養液，按照1.2.1的方法制備接種液，每個分裝的試管中分別加入0.1 mL的接種液。將接種后的試管分別置于溫度為0、5、10、15、20、25、28、30、35、40℃的ZWY-2102C全溫型多振幅軌道搖床上，160 r/min振蕩培養48 h，每組溫度設置3個重復，以不接菌培養液為對照，振蕩培養48 h后，在紫外分光光度計下測定并記錄菌液在不同溫度下的OD600值。

1.2.3 pH對病原菌生長的影響 用1 mol/L HCl和1 mol/L NaOH溶液將NA培養液的pH分別調整為4.0、5.0、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0。按照1.2.2的方法接種病原菌，每組處理設3個重復，以不接菌培養液為對照，將搖床設置成28℃、160 r/min，振蕩培養48 h。在搖床振蕩培養48 h后，在紫外分光光度計下測定并記錄菌液在不同pH下的OD600值。

1.2.4 NaCl濃度對病原菌生長的影響 以不加NaCl的NA培養液為基礎，將NA培養液中NaCl濃度分別配制成0%、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%。按照1.2.2的方法接種病原菌，每個NaCl濃度設3次重復，以不接菌培養液為對照，將搖床設置成28℃、160 r/min，振蕩培養48 h。在搖床振蕩培養48 h后，在紫外分光光度計下測定并記錄菌液在不同NaCl濃度下的OD600值。

1.3 室內藥劑毒力篩選試驗

采用濾紙片抑菌圈法進行測定[23]，參考王璐瑤等[24]報道的室內藥劑毒力篩選試驗，試驗分為2步進行，（1）按照田間推薦使用濃度將18種供試藥劑按有效成分用無菌水配制成5個濃度進行初篩試驗，每個濃度3個重復，以無菌水為對照。先用移液槍吸取用無菌水稀釋至106的菌懸液100μL，用涂布棒均勻地涂布在NA平板上，涂完后將平板靜置，待涂有菌的培養基表面干燥。用鑷子夾取直徑6 mm滅過菌的濾紙片，放入配制好的藥液中吸附1 min，再用鑷子將浸泡過藥劑的濾紙片取出，由于取出的濾紙片上吸附的藥劑過多，將濾紙片放在三角瓶瓶口壁上使多余的藥劑滴落，再用鑷子夾取濾紙片等距離的放置在NA平板上，每皿放置3片濾紙片，將平板置于28℃培養箱中培養24 h，采用十字交叉法測量不同藥劑在不同濃度下病原菌的抑菌圈大小。（2）將初篩中有抑菌效果的藥劑進行室內毒力測定試驗，以藥劑濃度的對數為自變量，抑菌圈的平均直徑為因變量，求出毒力回歸方程[25]，比較不同藥劑的EC50值。

1.4 數據分析

用SPSS 26.0軟件對試驗數據進行分析，比較各處理間的差異顯著性。

2 結果與分析

2.1 溫度對病原菌生長的影響

由圖1可以得出，病原菌在培養的溫度5～40℃內均能夠生長，病原菌的最適生長溫度為28℃。當病原菌培養的溫度在5℃以下時，病原菌的生長受到抑制。

圖1 病原菌在不同溫度下的生長情況

2.2 酸堿度對病原菌生長的影響

由圖2可以得出，病原菌在培養液的pH 5.0～11.0時均能夠生長，培養液pH 7最適宜病原菌的生長。培養液pH 6時紫外分光光度計下測得的菌液OD600值為1.074，而當培養液pH 8時紫外分光光度計下菌液OD600值0.797，說明菌體適宜在中性偏酸的環境中生長。當培養液pH 5.0以下、pH 11.0以上時，病原菌的生長停滯，病原菌的生長受到抑制。

圖2 病原菌在不同pH下的生長情況

2.3 鹽濃度對病原菌生長的影響

由圖3可以得出，病原菌的耐鹽性范圍為0%～12%，在該范圍內病原菌能夠生長。當培養液中的NaCl濃度為2%時，能夠促進病原菌的生長。當培養液中的NaCl濃度超過12%時，病原菌的生長停滯，病原菌的生長受到抑制。

圖3 耐鹽性測定

2.4 供試藥劑室內抑菌測定結果

由表2可以看出，供試的18種細菌殺菌劑在制劑推薦使用濃度范圍內，不同的藥劑對病原菌的抑制效果不同。18種供試藥劑中，四霉素、乙蒜素、氯溴異氰尿酸、77%志信在制劑推薦使用濃度范圍內設置的5個濃度下對病原菌均有抑制作用。2%春雷霉素僅在藥劑濃度為50、100 mg/L對病原菌有抑制作用，20%乙酸銅僅在藥劑濃度為10000 mg/L時對病原菌有抑制作用，在其余的濃度下無抑菌效果。其余的12種供試藥劑在田間推薦使用濃度范圍內設置的5個濃度對病原菌均無抑菌作用。

表2 18種殺菌劑在不同濃度下對辣椒細菌性果實條斑病菌抑制作用

由于只有四霉素、乙蒜素、氯溴異氰尿酸、77%志信這4種藥劑在田間推薦使用濃度范圍內設置的5個濃度均對病原菌有抑制效果，因此以這4種藥劑供試的藥劑濃度的對數為自變量，抑菌圈平均直徑為因變量，得到毒力回歸方程及EC50。

4種供試藥劑室內毒力測定結果（表3）表明，四霉素、乙蒜素、77%志信、氯溴異氰尿酸4種藥劑的EC50值分別為11.75、340.95、994.36、1464.71 mg/L，其中以四霉素的毒力最強，高于其余3種藥劑。

表3 4種殺菌劑室內毒力測定結果

續表2

3 結論與討論

辣椒細菌性果實條斑病是發生在新疆巴州和碩縣辣椒種植區的一種新病害，其病原菌為阿根廷假單胞菌(Pseudomonas argentinensis)，由于該病害是一種新病害，國內對于該病害的研究尚未有相關文獻的報道，為了給田間病害規律研究和病害防治提供理論依據基礎，本研究在前期病原菌準確鑒定的基礎上，對病原菌開展生物學特性及藥劑篩選試驗。對病原菌的部分生物學特性進行測定，結果表明病原菌在外界環境溫度為5～40℃范圍內均能生長，最適宜生長溫度范圍為25～35℃，6月為該病害高發期。病原菌在pH 5.0～11.0范圍內均能生長，菌體適宜在中性偏酸的環境中生長，最適pH 7.0，當pH 5.0以下、pH 11.0以上時，病原菌的生長停滯。病原菌在NaCl濃度為0%～12%范圍內均可以生長，其中以2%的NaCl濃度促進病原菌的生長，病原菌的耐鹽性為12%。

續表3

在病原菌的室內藥劑篩選試驗中，供試的18種細菌殺菌劑在田間推薦使用濃度下，四霉素、乙蒜素、氯溴異氰尿酸、77%志信在田間推薦使用濃度范圍內設置的5個濃度下對病原菌均有抑制作用，2%春雷霉素在藥劑濃度為50、100 mg/L對病原菌有抑制作用，20%乙酸銅僅在藥劑濃度為10000 mg/L時對病原菌有抑制作用，其余的12種供試藥劑在田間推薦使用濃度范圍內設置的5個濃度下對病原菌均無抑菌作用。毒力測定結果表明四霉素的毒力較強，EC50值為11.75 mg/L，毒力強于其他藥劑，可作為防治的首選。由于本試驗毒力測定結果僅是室內平板篩選出的結果，不同的藥劑作用在植物上的機理不同，其對病害的防效也不同，因此在室內篩選出的具有抑菌作用的藥劑，還需進一步試驗確定其防治效果及用于防治的最適濃度，為田間病害防治提供防治基礎。