細胞療法治療椎間盤退變研究進展*

劉 宇 杜傳超 海 寶 祝 斌 劉曉光△

（1 北京大學第三醫院骨科，北京100191；2 首都醫科大學附屬北京友誼醫院骨科中心，北京 100050）

腰痛(low back pain, LBP)是一種臨床常見癥狀，在工業化國家，其終生患病率約為60%～70%，不僅給人們帶來極大痛苦，也給社會造成了沉重的經濟損失[1]。隨人類預期壽命的增加，由腰痛引起的殘疾和支出還將進一步增加。由于腰痛帶來的巨大損失，很有必要對腰痛的病理生理過程及治療方法進行深入研究。約40%的慢性腰痛與椎間盤退變(intervertebral disc degeneration, IDD)密切相關，這類腰痛被稱為椎間盤源性腰痛[2]。目前針對椎間盤退變的治療尚存在各種弊端，暫無理想的治療方法，但隨著基礎研究的深入，以椎間盤再生為導向的細胞療法展現出較好的研究前景，有望成為治療IDD的新手段。本文對目前細胞療法的已有研究展開綜述，以期為椎間盤退變的治療提供更多研究思路。

一、椎間盤退變的原因與機制

椎間盤由髓核、纖維環和軟骨終板組成。髓核中蛋白聚糖帶有大量陰離子，滲透壓高，可吸水膨脹將壓縮負荷轉化為對纖維環的拉伸作用，纖維環則起到張力“皮膚”的作用以限制髓核膨脹[3]。退行性椎間盤疾病源于遺傳因素和環境之間的相互作用[4]。年齡、吸煙、感染、遺傳易感性、異常生物力學負荷、軟骨終板營養供應減少等因素均可能導致椎間盤發生退變。椎間盤退變始于髓核，早期改變為髓核中蛋白多糖降解增加[5]。這使得髓核含水量降低，生物力學性能減弱，所能承擔的壓縮負荷減小，更多負荷直接作用于纖維環[3,4]。由于纖維環的結構特點，其抵抗壓縮的能力遠不如抵抗拉伸的能力，因承受了較大的壓縮負荷，纖維環結構發生破壞[4]，纖維環整體膨脹，超過終板邊界，造成影像學上的椎間盤膨出。隨病變進展，內層纖維環先行破裂，造成包裹性椎間盤突出，進而外層纖維環也發生破裂，髓核完全突破纖維環，引起非包裹性椎間盤突出。凸入椎管或側隱窩區域的髓核可能壓迫馬尾和神經根，引起疼痛、運動障礙等癥狀。因椎間盤本身缺乏血液供應，一旦變性、損傷，很難自我修復[6]。

二、治療方法

1.傳統療法

退行性椎間盤疾病的治療手段包括非手術治療和手術治療，首選非手術治療，無效時需考慮手術治療。目前常用的治療方法包括髓核等離子射頻消融、臭氧治療[7]、突出髓核摘除、椎間融合術等。上述療法雖然可消除疼痛，但可能加速鄰近節段椎間盤的退變，導致相鄰椎間盤病變。由此可見，當前的治療手段只能消除或緩解部分疼痛，無法實現椎間盤再生和恢復正常的椎間盤功能，且存在較多并發癥，弊端較為明顯。

2. 細胞療法

近年來，對椎間盤退變病理生理學研究為椎間盤再生療法開辟了新途徑[8]。髓核內常駐細胞通過維持細胞數量和細胞外基質以維持髓核的正常功能[9]，而退變椎間盤以細胞減少、細胞外基質丟失和高度降低為標志[10]。Buckwalter 等[11]提出椎間盤退變與髓核細胞丟失有關，在各種因素作用下，髓核細胞功能減退，細胞外基質合成代謝和分解代謝之間的平衡被破壞，蛋白多糖含量減少，II 型膠原逐漸被I 型膠原取代，髓核組成成分改變[12]，椎間盤功能減退并可能引發盤源性腰痛。由于髓核細胞起到了維持椎間盤穩態的重要作用，細胞療法為治療退行性椎間盤疾病提供了一種潛在的解決方案[12]。這種治療策略是指將健康細胞輸送到椎間盤中，以補充丟失的細胞并增加蛋白多糖和膠原的含量[13]，進而恢復椎間盤正常的組織結構和生物力學功能。

三、常用細胞類型

用健康細胞治療椎間盤退變的目的是移植能夠分泌功能性細胞外基質的細胞以恢復組織穩態，或移植具有免疫抑制和抗炎特性的干細胞治療炎癥[8]。目前應用的細胞包括髓核細胞、間充質干細胞、椎間盤祖細胞、誘導性多能干細胞等（見表1）。

表1 目前常用的細胞優缺點總結如下

1.髓核細胞

細胞療法最先應用的細胞為自體髓核細胞(nucleus pulposus cells, NPCs)。Meisel 等[14]從犬椎間盤中分離出髓核細胞，體外培養擴增后移植入自體椎間盤，結果表明移植的髓核細胞可存活，保持了原位增殖能力并產生了正常的細胞外基質。Meisel等繼而進行了一項為期2 年的臨床試驗以評估自體椎間盤軟骨細胞移植在人群中的長期療效，結果顯示接受髓核細胞移植的病人疼痛減輕，椎間盤含水量高于對照組。

然而NPCs 移植存在諸多缺陷。椎間盤中細胞數量較低，其功能在退變過程中會逐漸減退[15]，退變椎間盤分離得到的髓核細胞表現出早衰和分解代謝表型[16,17]。因此髓核細胞來源有限、質量欠佳，不是理想的細胞來源。同時自體椎間盤細胞移植技術僅適用于接受椎間盤切除手術的病人，在椎間盤退變的早期進行椎間盤細胞移植可能會取得更好效果，但對這些病人行椎間盤切除手術可能會加速退變。基于這些原因，NPCs 并不適合作為移植細胞。

2.間充質干細胞

間充質干細胞(mesenchymal stem cells, MSCs)是一個多潛能細胞的異質性群體，具有多能性，可向成骨、成軟骨、成脂肪等方向分化，有修復受損組織的潛力[18]，是目前在骨組織工程中應用最為廣泛的成體干細胞。研究表明MSCs 可分化為髓核細胞樣表型，有望成為椎間盤修復的理想細胞來源。

（1）骨髓源性MSCs：Risbud 等[19]發現，缺氧環境和轉化生長因子β (transforming growth factor-β,TGF-β) 可 使 骨 髓 源 性MSCs(bone marrow-derived mesenchymal stem cell, BM-MSCs)分化為髓核細胞樣表型。Noriega 等[20]的隨機對照試驗發現將BMMSCs 注入退變椎間盤后，病人的各項功能指標均有顯著改善。Ukeba 等[21]將兔BM-MSCs 移植入退變椎間盤，發現BM-MSCs 可向髓核細胞分化同時激活了內源性髓核細胞，椎間盤內生長因子和細胞外基質含量增加，椎間盤得以再生。在退變過程中炎癥因子也發揮了重要作用[3]，MSCs 可通過調節促炎和抗炎途徑減緩細胞早衰[22]。BM-MSCs 能分泌細胞生長因子，抑制炎癥反應，且療效持久。Li 等[23]將鼠BM-MSCs 與退變髓核細胞共同培養，發現BMMSCs 可降低退變髓核細胞中β-半乳糖苷酶和基質金屬蛋白酶9 的表達，下調TGFβ/NF-κB 信號轉導，增加II 型膠原和髓核細胞數量。這表明BM-MSCs可減輕炎癥誘導的髓核細胞衰老并恢復髓核細胞的活性和功能。但該實驗僅為體外初步研究，在體內復雜環境中MSCs 能否發揮抗炎作用還需進一步驗證。

（2）脂肪源性MSCs：脂肪源性MSCs (adiposederived mesenchymal stem cells, AD-MSCs)來源豐富，獲取方式簡便，可分化為脂肪細胞、軟骨細胞、成骨細胞等，也有望成為治療椎間盤退變的種子細胞。Tao 等[24]發現，在II 型膠原的刺激下，AD-MSCs 可分化為髓核樣細胞。Zhou 等[25]構建可注射水凝膠包裹AD-MSCs，注入大鼠尾椎，結果表明AD-MSCs可分化為髓核樣細胞，促進大鼠尾椎髓核再生。Kumar 等[26]的臨床研究證實了AD-MSCs 和HA 衍生物聯合注射療法的安全性和耐受性：實驗組病人疼痛改善，椎間盤含水量增加，初步驗證了該療法的有效性。Hua 等[27]應用音猥因子通路激活劑(smoothened agonist, SAG)激活細胞上的Shh 受體，發現SAG 與轉化生長因子β3 (transforming growth factor-β3, TGF-β3)聯用可增加AD-MSCs 的細胞外基質合成，提高NP 特異性標記基因和蛋白表達水平，進而可改善退變IVD 的高度、含水量、細胞外基質含量和結構，有望用于治療退行性椎間盤疾病。

盡管目前MSCs 應用廣泛，也有很多積極的研究結果表明其在修復退變椎間盤方面很有希望，但退變椎間盤低氧和炎癥環境下的低細胞存活率、細胞滲漏可能導致贅生物形成等問題是目前MSCs 治療所面臨的主要挑戰[28]。

（3）椎間盤祖細胞：椎間盤的微環境較為極端，如營養缺乏、高滲透壓和酸性pH 等，這些環境不利于細胞生存。Wuertz 等[29]發現移植到椎間盤內的MSCs 基質蛋白表達和增殖下降。Risbud 等[30]發現人退變椎間盤中存在祖細胞，這意味著椎間盤中可能包含一個靜止的祖細胞樣群，激活這些祖細胞可用于椎間盤的再生[31]。由于MSCs 是一種組織特異性多能祖細胞，具有獨特的表達譜，反映了其起源和微環境[32]，由此推測椎間盤祖細胞可能比非椎間盤來源的MSCs 在髓核細胞分化方面具有更好的潛能以及更好的適應能力。Wang 等[33]從大鼠尾部椎間盤分離出椎間盤祖細胞, 利用多肽修飾的水凝膠作為載體注入大鼠退變椎間盤，發現椎間盤祖細胞能夠存活至少30 天并產生了再生效應。目前使用椎間盤祖細胞治療退行性椎間盤疾病的人類首個I期臨床試驗正在進行中，以進一步研究椎間盤祖細胞在椎間盤修復中的潛力，并確定其在椎間盤再生方面是否優于MSCs[31]。

相較于MSCs，椎間盤祖細胞具有以下優點[34]：①一般取自椎間盤突出癥病人的手術標本，可避免分離其他類型MSCs 所造成的損傷；②在耐受椎間盤惡劣微環境方面優于其他MSCs。

然而目前對椎間盤祖細胞的了解仍然很有限：①對椎間盤祖細胞的生物學特性了解不多，椎間盤祖細胞的表面標記仍然存在爭議；②如何簡便、經濟地分離出更純凈的椎間盤祖細胞仍有待探索；③如何保護椎間盤祖細胞免受衰老、退化和惡劣微環境的影響尚未闡明[34]。

（4）誘導性多能干細胞：誘導性多能干細胞(induced pluripotent stem cells, IPSCs)在多能性方面類似于胚胎干細胞，但倫理問題較少。雖然MSCs是目前廣泛應用于骨組織工程的種子細胞，但其再生潛力似乎隨年齡增長而下降， IPSCs 為解決這個問題提供了可行方案[35]。目前應用IPSCs 治療椎間盤退變主要有兩個方面：誘導其分化為脊索細胞或髓核樣細胞。

分化為脊索細胞：在青少年椎間盤中，髓核內主要是脊索細胞，成年后脊索細胞消失，取而代之的是更小的軟骨樣細胞，目前認為這些細胞由脊索細胞分化而來[36～38]。McCann 等[36]發現脊索細胞是成熟椎間盤髓核內所有細胞的胚胎前體細胞，脊索細胞的耗竭可能會影響髓核的正常功能。脊索細胞在刺激髓核細胞合成糖胺聚糖和蛋白多糖方面起著重要作用[39]，一些體外實驗也表明脊索細胞可控制髓核細胞合成蛋白多糖，有望成為治療椎間盤退變的種子細胞。然而人類脊索細胞自童年時期開始消失，來源有限，不能作為種子細胞[40]。Liu 等[41]的體外實驗發現，人IPSCs 在豬髓核組織基質中培養可分化為脊索細胞，為大量生產高質量脊索細胞實現椎間盤再生提供了可能。Sheyn 等[40]的可重復分化方案可使IPSCs 分化為脊索細胞并在體內和體外保持表型至少8 周，在豬椎間盤退變模型中能夠發揮保護作用。

分化為髓核樣細胞：IPSCs 也可分化為髓核樣細胞。Tang 等[42]根據脊索細胞和髓核細胞的發育情況證實了一種可促進IPSC 在體外分化為髓核樣細胞的培養基補充方案，這種髓核樣細胞有再生椎間盤的潛力。Xia 等[43]則采用了“兩步走”方法：第一步誘導IPSCs 分化為中胚層細胞(mesoblastic cells, MCs)，第二步誘導MCs 分化為髓核樣細胞，將髓核樣細胞注入大鼠尾椎間盤內治療椎間盤退變。結果顯示椎間盤高度恢復，含水量增加，髓核細胞及其細胞外基質部分恢復，椎間盤退變得以逆轉。

雖然IPSCs 能克服MSCs 的增殖受限或體外擴增后復制衰老等問題，然而目前IPSCs 應用于椎間盤再生的研究仍十分有限。同時IPSCs 在分化過程中存在腫瘤形成風險，目前仍不太可能在臨床上廣泛應用[35]。盡管IPSCs 為細胞療法帶來了巨大希望，但在用于臨床試驗之前仍有一些安全問題需要考慮。

四、總結與展望

椎間盤退變的病理過程較為復雜，目前尚未完全闡明。基于退變椎間盤內細胞數量減少、功能減退這一現象，研究者希望通過補充椎間盤內細胞達到恢復正常細胞外基質，逆轉椎間盤退變這一目的。但目前仍有一些關鍵性問題尚待解決，未來的研究應著眼于以下問題：①細胞存活：椎間盤內營養缺乏、滲透壓高、pH 值低，微環境較為極端，同時椎間盤還需承擔較大的壓縮負荷，這些不利因素為細胞存活帶來了巨大的挑戰。然而目前的研究時間均較短，細胞能否在退變環境中長期存活尚不清楚；②動物模型：目前使用的動物模型均為人工誘導退變，與人類椎間盤自發退變的發病機制不同，同時動物椎間盤受力也與人類存在差異，仍需尋找合適的動物模型和造模方法以更真實的模擬人類椎間盤退變過程；③細胞來源：由于BM-MSCs 的可獲得性和增殖能力，目前普遍認為是椎間盤再生臨床試驗中的最佳供體細胞候選者，但仍不能忽視治療過程中骨贅和腫瘤發生的可能性。其他類型細胞有可能是更好的功能性細胞來源，但仍需進一步研究以確定這些細胞用于椎間盤再生的益處和局限性；④支架材料：在細胞治療中由于椎間盤內壓力較高，直接注射細胞會導致細胞滲漏，需要支架材料的參與。理想情況下，支架材料應該能為細胞重新構建細胞外基質，刺激細胞增殖和分化[44]，同時支架材料還應該具有良好的力學性能以承擔較重的壓縮負荷。目前適合于椎間盤再生的理想支架材料仍在研究之中；⑤治療時機：退行性椎間盤疾病的病程較長，需通過研究確定細胞治療的合適時機。

雖然細胞治療退行性椎間盤疾病的研究目前還主要集中在體外實驗和動物實驗方面，處于臨床轉化的早期階段，但這些研究表明基于細胞療法治療椎間盤疾病已取得了一定進展。隨著研究的不斷深入，在不久的將來，細胞治療有望成為一些椎間盤退變疾病病人的治療選擇。