高血壓病氣虛血瘀證患者血清對CRL-1730凋亡相關基因、miRNA表達的影響及補陽還五湯的干預作用

胡小勤， 蒙 丹， 吳燕春， 段慧明， 曾雪霞， 陶美霖， 蘇日香， 曾學文*

(1.廣西中醫藥大學藥學院， 南寧 530022； 2.廣西中藥藥效研究重點實驗室， 南寧 530022)

高血壓是致死和致殘的首要因素之一，據統計，2030年全球由高血壓導致的癡呆患者將達到 7 550 萬[1]。研究表明，心血管疾病中50%以上是由高血壓引起的,77%左右腦卒中患者有較長的高血壓病史，高血壓已成為影響人民健康生活的主要疾病[2]。高血壓病是以體循環動脈壓增高為主要臨床表現的綜合征，是臨床最常見的心血管疾病[3]，氣虛血瘀證又是高血壓病的常見中醫證型[4]。研究表明，高血壓病的發病機制[5]及氣虛血瘀證的形成機理[6]都與細胞凋亡的病理生理過程有密切的關系。細胞凋亡是通過激活和啟動細胞內某些特定基因,調控細胞主動死亡過程, 維護內環境穩定[7]。而研究發現半胱氨酸蛋白酶(Caspases)在細胞凋亡、炎癥和纖維化中起核心作用，Caspases的激活是細胞凋亡必經的途徑，Caspase-3是反應的關鍵節點[8]，且人體抑癌基因53(p53)是一種調節許多基因表達的轉錄因子，可誘導細胞的凋亡和衰老[9]。

臨床上廣泛應用補陽還五湯治療高血壓病氣虛血瘀證, 且研究證實了補陽還五湯可以糾正高血壓病氣虛血瘀證引起的細胞凋亡[10]，并通過抑制氣虛血瘀型高血壓腦出血恢復期患者神經凋亡,改善血液循環,提高療效[11]。課題組前期研究發現：高血壓病氣虛血瘀證患者血清可以誘導血管內皮細胞凋亡[12]，并在蛋白質層次發現其機制可能與調節半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)、p53、跨膜糖蛋白(Fas)、跨膜糖蛋白配體(FasL)、兔抗人單克隆抗體(Bax)、B淋巴細胞瘤-2基因(Bcl-2)的表達量有關，并發現補陽還五湯對內皮細胞凋亡有一定的保護作用[13]。故在課題的前期研究基礎上運用實時定量聚合酶鏈式反應(palymerase chain reaction,PCR)芯片技術和miRNA芯片技術，對凋亡細胞的相關基因和miRNA表達進行檢測，從mRNA和miRNA層面探討高血壓病氣虛血瘀證患者血清誘導內皮細胞凋亡的機理。以體外培養的人臍靜脈血管內皮細胞作為觀察對象，進一步探討高血壓氣虛血瘀證的患病機制，對促進高血壓病的防治和提高人民生活健康具有深遠的意義。

1 材料

1.1 實驗動物

60只SPF(specific pathogen free)級SD(Sprague-Dawley)大鼠，雌雄各30只，體重180～210 g，由廣西醫科大學實驗動物中心提供，動物生產許可證號：SCXK(桂)2014—0002。

1.2 細胞

人臍靜脈內皮細胞株CRL-1730，由復旦生物醫學研究院細胞資源中心提供。

1.3 試劑

胎牛血清、青霉素、鏈霉素購自Hyclone；高糖DMEM購自Gibco；0.25%胰酶-0.02%EDTA購自北京索萊寶；聚乙二醇辛基苯基醚(TritonX-100)、牛血清白蛋白(BSA)購自BioFrox；一抗p53、Bax、Fas、Casapse-3、Fas-L、Bcl-2、微管蛋白(Tublin)均購自Sant Cruz；二抗Cy-3羊抗鼠；正常熔點瓊脂糖(NMA)、低熔點瓊脂糖(LMA)購自Takara；溴化乙錠(EB)購自Sigma；三(羥甲基)胺基甲烷(Tris)購自南京凱基；RIPA組織細胞快速裂解液購自Boster；乙二胺四乙酸二鈉(Na2EDTA)購自上海前尖生物科技有限公司。

1.4 儀器

低溫臺式離心機、CO2培養箱為美國Thermo公司生產；水平電泳槽、電泳儀為美國BIO-RAD公司生產；微量移液器為德國Eppendorf公司生產；實時定量PCR儀為美國Bio-Rad公司生產。

2 資料與方法

2.1 健康體檢者及患者的選擇

選擇健康對照組20例，為廣西中醫藥大學附屬瑞康醫院健康體檢者。高血壓病氣虛血瘀證患者及高血壓病非氣虛血瘀證患者各40例，為2016年7月—2017年1月在廣西中醫藥大學附屬瑞康醫院心血管內科就診的高血壓病患者。高血壓病診斷標準采用1999年世界衛生組織/國際高血壓學會制定的診斷標準，氣虛血瘀證辨證標準采用1986年全國中西醫結合虛證及老年病防治學術會議制訂的《中醫虛證辨證參考標準》及2011年中國中西醫結合學會活血化瘀專業委員會制定的《血瘀證中西醫結合診療共識》。高血壓病氣虛血瘀證血壓水平與高血壓病非氣虛血瘀證患者的血壓水平比較，兩者無統計學差異，P>0.05，具有可比性；高血壓病氣虛血瘀證、高血壓病非氣虛血瘀證及健康對照組三組性別和年齡比較，無統計學差異，P>0.05，具有可比性。

2.2 健康人及患者血清收集

空腹狀態下，每人約取8 mL外周血，放入帶帽無菌不抗凝試管，自凝后4 ℃、3 000 r/m、15 min離心，取上清液置于無菌EP(eppendorf)管，混合均勻，滅活，過濾除菌，置于-80 ℃環境，備用。每組血清混合后用于細胞學實驗。

2.3 含藥血清及空白對照血清制備

按補陽還五湯原方劑量進行水煎提取(生黃芪120 g、當歸尾6 g、赤芍5 g、地龍3 g、川芎3 g、紅花3 g、桃仁3 g)。按照體表面積換算用藥量，高、中、低劑量組大鼠分別用等效劑量的2、1、1/2倍，即24、12、6 g/(kg·d)灌胃(ig)。將SD大鼠隨機分為空白對照組和補陽還五湯高、中、低劑量組，空白對照組共30只，補陽還五湯高、中、低劑量組各10只。各劑量組每天以補陽還五湯 ig 2次，兩次間隔12 h，連續ig 3 d。于末次ig 1 h后頸動脈放血，自凝后 4 ℃、3 000 r/m、15 min離心，取上清液，將同組血清混合，放入無菌EP管，混勻，滅活，過濾除菌，-80 ℃ 凍存備用。在同樣條件下，以等體積的生理鹽水ig，制備空白對照組血清。

2.4 分組

分6組按以下方法制備混合血清培養液：高血壓病氣虛血瘀證組、高血壓病非氣虛血瘀證組、健康對照組分別以10%高血壓病氣虛血瘀證患者血清、10%高血壓病非氣虛血瘀證患者血清、10%健康者血清混合10%空白血清及80%的高糖DMEM培養基，補陽還五湯高、中、低劑量組分別以10%補陽還五湯高中、低劑量含藥血清混1血高血壓病氣虛血瘀證患者血清及80%高糖DMEM培養基。

2.5 細胞培養

取對數生長期內皮細胞，消化、傳代后， 按1×105/mL密度, 接種于25 mL培養瓶, 4 mL/瓶，每組6瓶，共36瓶，每2瓶為一個樣品。用含10%胎牛血清的高糖DMEM培養基培養24 h后，換無血清培養液同步化以后，分為6組，繼續培養24 h。

2.6 實時定量PCR芯片技術檢測與人細胞凋亡相關的89個關鍵基因的表達

核糖核酸(RNA)抽提，脫氧核糖核酸酶I (DNase I) 消化RNA樣品，RNA純化，RNA質量檢測，反轉錄為互補脫氧核糖核酸(cDNA)鏈，作為PCR模板；將模板加入到熒光定量PCR(RT2 Real-Time TM SYBR Green PCR Master Mix)反應體系中。取96孔板，在各孔中固定好基因特異性引物，然后加入等量的PCR反應體系，進行PCR反應。采用配套軟件計算PCR芯片中的每個基因的循環閾值(Ct)。采用△△Ct方法比較對應的兩個樣本中同一基因的表達量變化。通過分析看家基因Ct值的一致性，確定合適的標準化方法。

2.7 miRNA芯片技術檢測與人細胞凋亡相關的384個miRNAs表達

方法同2.6。

2.8 miRNA靶基因預測

應用數據庫Targetscan，查詢miRNA的靶基因，網址: http://www.targetscan.org/vert_71/。

2.9 篩選目的差異靶基因

對miRNA靶基因預測結果及差異表達的基因作交集分析，即為目的差異的靶基因。

3 結果

3.1 實時定量PCR芯片技術檢測結果

實時定量PCR芯片技術檢測結果如圖1所示。

高血壓病氣虛血瘀證組與高血壓病非氣虛血瘀證組比較，共檢測到2個差異基因，均表達上調。上調基因包括CIDEA和FASLG。但是無統計學差異，如表1所示。

表1 高血壓病氣虛血瘀證組與高血壓病非氣虛血瘀證組 mRNA差異表達(n=3)

高血壓病氣虛血瘀證組與健康對照組比較，共檢測到27個差異表達基因，其中，有25個上調基因和2個下調基因，有統計學差異的上調基因22個，下調基因1個(P<0.05)，上調基因包括BCL10、BCL2A1、BCL2L1、BIK、BNIP2、BRAF、CASP10、CASP3、CASP4、CASP5、CFLAR、GADD45A、HRK、MCL1、RIPK2、TNFRSF10B、TNFRSF11B、TNFRSF9、TNFSF8、TP53、TP53BP2、XIAP，下調基因為TNFSF10，如表2所示。

表2 高血壓病氣虛血瘀證組與健康對照組mRNA 差異表達(n=3)

每組3個樣本，A～F依次為高血壓病氣虛血瘀證組、高血壓 病非氣虛血瘀證組、健康組、補陽還五湯高劑量組、補陽還 五湯中劑量組、補陽還五湯低劑量組圖1 DNA變性瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.1 DNA denaturation agarose gel electrophoresis

高血壓病非氣虛血瘀證組與健康對照組比較，共檢測到24個差異表達基因，其中，有21個上調基因和3個下調基因，有統計學差異的上調基因19個和下調基因1個 (P<0.05)。上調基因包括BCL10、BCL2A1、BCL2L1、BIK、BNIP2、CASP3、CASP4、CASP5、CFLAR、GADD45A、HRK、MCL1、RIPK2、TNFRSF10B、TNFRSF9、TNFSF8、TP53、TP53BP2、XIAP，下調基因為TNFSF10，如表3所示。

表3 高血壓病非氣虛血瘀證組與健康對照組mRNA 差異表達(n=3)

補陽還五湯高劑量組與高血壓病氣虛血瘀證組比較，共檢測到9個差異表達基因，其中，有6個上調基因和3個下調基因，有統計學差異的上調基因5個和下調基因1個 (P<0.05)，上調基因包括BCL2、DAPK1、GADD45A、NFKB1、TRADD，下調基因為CASP10，如表4所示。

表4 補陽還五湯高劑量組與高血壓病氣虛血瘀證組 mRNA 差異表達(n=3)Table 4 Differential mRNA expression between the high-dose group of Buyanghuanwu Decoction and the hypertension group with qi deficiency and blood stasis syndrome (n=3)

補陽還五湯中劑量組與高血壓病氣虛血瘀證組比較，共檢測到13個差異表達基因，其中，有8個上調基因和5個下調基因，有統計學差異的上調基因7個，下調基因3個 (P<0.05)，上調基因包括BCL2、BCL2A1、BIRC3、DAPK1、GADD45A、NFKB1、TRADD，下調基因包括CASP10、CASP5、TNFRSF9，如表5所示。

表5 補陽還五湯中劑量組與高血壓病氣虛血瘀證組 mRNA 差異表達(n=3)

補陽還五湯低劑量組與高血壓病氣虛血瘀證組比較，共檢測到11個差異表達基因，其中，有5個上調基因和6個下調基因，有統計學差異的上調基因5個，下調基因3個 (P<0.05)，上調基因包括BCL2、DAPK1、GADD45A、NFKB1、TRADD，下調基因為CASP1、CASP10、TNFRSF9，如表6所示。

表6 補陽還五湯低劑量組與高血壓病氣虛血瘀證組 mRNA差異表達(n=3)

3.2 miRNA芯片技術檢測結果

miRNA芯片技術檢測結果如圖2所示。高血壓病氣虛血瘀證組與高血壓病非氣虛血瘀證組比較，共檢測到38個差異表達基因，其中，有14個上調基因和24個基因下調，有統計學差異的上調基因1個和下調基因3個 (P<0.05)，上調基因包括hsa-miR-299-5p，下調基因分別為hsa-miR-516a-5p、hsa-miR-382-5p、hsa-miR-153-3p。結果如表7所示。

每組3個樣本，A～F依次為高血壓病氣虛血瘀證組、高血壓病 非氣虛血瘀證組、健康組、補陽還五湯高劑量組、補陽還五 湯中劑量組、補陽還五湯低劑量組圖2 DNA變性瓊脂糖凝膠電泳圖(1∶1)Fig.2 DNA denaturation agarose gel electrophoresis (1∶1)

表7 高血壓病氣虛血瘀證組與高血壓病非氣虛血瘀證組 miRNA差異表達(n=3)

高血壓病氣虛血瘀證組與健康對照組比較，共檢測到29個差異表達基因，其中，有17個上調基因和12個下調基因，有統計學差異的上調基因8個和下調基因2個 (P<0.05)，上調基因包括hsa-miR-181a-3p、hsa-miR-99a-3p、hsa-miR-30b-3p、hsa-miR-22-5p、hsa-miR-449a、hsa-miR-21-3p、hsa-miR-26a-2-3p、hsa-miR-212-3p，下調基因為hsa-miR-127-3p、hsa-miR-874-3p。結果如表8所示。

表8 高血壓病氣虛血瘀證組與健康對照組miRNA 差異表達(n=3)

高血壓病非氣虛血瘀證組與健康對照組比較，共檢測到45個差異表達基因，其中，有31個上調基因和14個下調基因，有統計學差異的上調基因12個和下調基因2個 (P<0.05)，上調基因包括hsa-miR-374b-3p、hsa-miR-181a-3p、hsa-miR-376b-3p、hsa-miR-99a-3p、hsa-miR-30b-3p、hsa-miR-22-5p、hsa-miR-449a、hsa-miR-375、hsa-miR-21-3p、hsa-miR-26a-2-3p、hsa-miR-140-3p、hsa-miR-212-3p，下調基因為hsa-miR-190a-5p、hsa-miR-874-3p。結果如表9所示。

表9 高血壓病非氣虛血瘀證組與健康對照組miRNA 差異表達(n=3)

補陽還五湯高劑量組與高血壓病氣虛血瘀證組比較，共檢測到64個差異表達基因，其中，有60個上調基因和4個下調基因，有統計學差異的上調基因6個(P<0.05)，下調基因無統計學差異。上調基因包括hsa-miR-499a-5p、hsa-miR-570-3p、hsa-miR-887-3p、hsa-miR-548c-3p、hsa-miR-134-5p、hsa-miR-135a-5p。結果如表10所示。

表10 補陽還五湯高劑量組與高血壓病氣虛血瘀證組 miRNA差異表達(n=3)

補陽還五湯中劑量組與高血壓病氣虛血瘀證組比較，共檢測到21個差異表達基因，其中，有5個上調基因和16個下調基因，上調基因無統計學差異，有統計學差異的下調基因3個 (P<0.05)，分別為hsa-miR-129-5p、hsa-miR-190a-5p、hsa-miR-411-5p。結果如表11所示。

表11 補陽還五湯中劑量組與高血壓病氣虛血瘀證組 miRNA差異表達(n=3)

補陽還五湯低劑量組與高血壓病氣虛血瘀證組比較，共檢測到41個差異表達基因，其中，有33個上調基因和8個下調基因，有統計學差異的上調基因3個和下調基因1個 (P<0.05)，上調基因包括hsa-miR-187-3p、hsa-miR-708-5p、hsa-miR-139-5p，下調基因為hsa-miR-410-3p。結果如表12所示。

表12 補陽還五湯低劑量組與高血壓病氣虛血瘀證組 miRNA差異表達(n=3)

3.3 miRNA靶基因預測結果及差異靶基因確定

3.3.1 高血壓病氣虛血瘀證組與健康組比較

有22個顯著上調的mRNA，1個顯著下調的mRNA；8個顯著上調的miRNA，2個顯著下調的miRNA。對8個上調miRNA做靶基因預測，發現這8個上調的miRNA可以靶向3 041個mRNA；下調的mRNA(1個)與上調的miRNA(8個)的靶基因(3 041個)取交集，得到1個既有顯著變化的 mRNA，也是上調miRNA的靶基因，即TNFSF10。

3.3.2 高血壓病非氣虛血瘀證組與健康組比較

有19個顯著上調的mRNA，1個顯著下調的mRNA；13個顯著上調的miRNA，2個顯著下調的miRNA；對13個miRNA做靶基因預測，發現這13個上調的miRNA可以靶向3 680個mRNA；下調的mRNA(1個)與上調的miRNA(13個)的靶基因(3 680個)取交集，得到1個既有顯著變化的mRNA，也是上調miRNA的靶基因，也是TNFSF10。

3.3.3 其余各組之間比較

差異mRNA和miRNA靶基因沒有交集。

4 討論

細胞凋亡(apoptosis)是由基因控制的細胞主動死亡過程[14]。實時定量PCR芯片(RT-qPCR array)借助基因芯片的高通量檢測技術與功能和qPCR 的精確定量，能同時對上百個基因的mRNA表達進行定量分析，是一種可靠的、高度靈敏的分析方法[15]。micro RNAs(miRNAs)是一種21～25 nt的單鏈小分子RNA，是非編碼RNA的重要組成部分，miRNAs具有高度的保守性、時序性和組織特異性[16]。近年來，越來越多的研究表明，miRNA能夠靶向調控凋亡因子的激活劑或抑制劑，進而影響凋亡因子的表達，也可以直接靶向凋亡調控因子，影響細胞凋亡的進程[17-19]。

實驗結果發現：高血壓氣虛血瘀證組與健康組相比，在89個mRNA中，有22個上調基因和1個下調基因，具有統計學差異(P<0.05)，在384個mi RNA中有8個上調miRNA和2個下調miRNA，顯示有統計學意義(P<0.05)；高血壓非氣虛血瘀證組在89個相關基因中有19個上調基因和1個下調基因，具有統計學差異(P<0.05)，在384個miRNA中有12個上調miRNA和2個下調miRNA，具有統計學差異(P<0.05)。另外，補陽還五湯高劑量組在89個相關基因中有5個上調基因和1個下調基因，具有統計學差異(P<0.05)，在384個miRNA中只有6個上調miRNA，具有統計學差異(P<0.05)；補陽還五湯中劑量組在89個相關基因中有7個上調基因和3個下調基因，具有統計學差異(P<0.05)；在384個miRNA中只有3個下調miRNA，具有統計學差異(P<0.05)；與高血壓病氣虛血瘀證組相比，補陽還五湯低劑量組在89個相關基因中有5個上調基因和3個下調基因，具有統計學差異，在384個miRNA中有3個上調miRNA和1個下調miRNA，具有統計學差異(P<0.05)。

本實驗結果說明：高血壓病氣虛血瘀證患者血清誘導內皮細胞凋亡的機制，與相關基因和mi RNA的上調和下調有關，補陽還五湯各劑量組能糾正高血壓病氣虛血瘀證的相關基因和miRNA表達的失衡，具有抑制高血壓病氣虛血瘀證細胞凋亡的作用。將miRNA靶基因預測結果與差異mRNA做交集分析，發現與高血壓病氣虛血瘀證和高血壓病非氣虛血瘀證的形成密切相關的核心因子都是TNFSF10 基因。腫瘤壞死因子 (tumor necrosis factor,TNF) 是Carswell 等于1975 年發現的一種能使腫瘤細胞凋亡、壞死的細胞因子[20]。TNFSF10(TRAIL)是在其序列同源性的基礎上，由Wiley等[21]于 1995年首次發現，是腫瘤壞死因子配體家族的成員之一，TNFSF10對體外的細胞系包括一些腫瘤細胞系具有誘導凋亡的作用。與其他 TNF 家族成員相比，TNFSF10具有兩個特性：①TNFSF10在大多數組織中都能表達，而其他TNF 家族成員只在活化的細胞中暫時表達[22]；②TNFSF10是一個促凋亡配體，目前發現在一些炎癥細胞和腫瘤細胞中能夠高表達。但是，關于TNFSF10促進內皮細胞凋亡的研究，尚未見報道。下一步，擬進行擴大樣本的實時熒光定量PCR(qPCR)和蛋白質印跡法(western blot)驗證，每組取20個樣本，對TNFSF10基因和蛋白質表達進行檢測。TNFSF10得到驗證后，可以作為高血壓病的一種分子標志物，在臨床診斷方面尤其是高血壓病的預警方面發揮作用，此外，也可以作為降壓藥物的療效評價的指標。