貝伐珠單抗聯合高壓氧治療小鼠膠質母細胞瘤的效果

王 鵬 劉邦鑫 張劍寧 陳金輝 常洪波 楊 晨

膠質母細胞瘤（glioblastoma，GBM）是侵襲性極強的顱內惡性腫瘤，即使采用手術聯合術后放化療等綜合治療，中位生存時間僅14 個月[1]。GBM 高表達血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF），理論上抗VEGF 治療具有良好效果，但Ⅲ期臨床試驗（AVAglio 和RTOG 0825）表明，貝伐珠單抗（bevacizumab，Bev）、放療和替莫唑胺的聯合治療方案，并未提高新診斷的GBM病人總生存期[2，3]。并且，抗VEGF靶向治療后，膠質瘤細胞的侵襲能力明顯增強[4，5]。高壓氧（hyperbaric oxygen，HBO）可抑制基質金屬蛋白酶9（matrix metalloproteinase 9，MMP-9）的表達，從而抑制腫瘤細胞的浸潤[6～9]。另外，HBO 可直接抑制腫瘤細胞增殖或通過提高放化療的敏感性，在多種腫瘤的治療中發揮作用[10～12]。本文探討Bev聯合HBO對小鼠GBM的治療作用。

1 材料與方法

1.1 細胞培養GBM 細胞系U251 細胞（中國人民解放軍空軍軍醫大學神經外科研究所章翔教授惠贈）用含10 ml/L 胎牛血清（美國Gibco 公司）的DMEM（美國Hyclone公司）培養基培養。

1.2 MTT 法檢測Bev 作用濃度 將U251 細胞接種至24 孔板，每孔1×104個細胞，1 d 后（細胞貼壁），加入不同濃度Bev（0、2、4、6、8、10 mg/ml）。繼續培養2、4、6 d，MTT試劑盒（美國Sigma公司）測定吸光度值，繪制細胞生長曲線，確定后續實驗Bev的濃度。

1.3 分組及處理 將U251細胞分為4組：對照組、Bev組、HBO 組和Bev+HBO 組。HBO 處理方案：采用煙臺豪特氧業設備有限公司的動物實驗艙，按操作說明，在30 min內穩定升高至0.2 MPa，持續60 min，然后在30 min 內降至常壓后出艙，加壓時注意氧艙溫度不超過37℃。對照組不進行任何處理；Bev組加入6 mg/ml的Bev作用24 h；HBO組接受1次HBO治療；Bev+HBO組在加入6 mg/ml的Bev作用24 h后，接受HBO 治療1 次。在HBO 組和Bev+HBO 組接受HBO治療時，對照組和Bev組細胞從孵箱取出，放于室溫（25 ℃）120 min。

1.4 MTT 法檢測細胞增殖能力 將U251 細胞接種至24 孔板，每孔1×104個細胞，每組接種9 孔。24 h 后（細胞貼壁）行不同處理，繼續培養48 h，每組取3孔計數，以MTT法測定吸光度值。

1.5 劃痕實驗檢測細胞遷移能力 以1×105細胞/孔的密度，將U251細胞接種于6孔板中，生長至90%的融合度后，用200 μl槍頭垂直于六孔板底部劃痕，無血清DMEM 培養液洗去除劃下的細胞，以無血清培養基培養。各組細胞行相應處理后，用倒置相差顯微鏡記錄此時及24 h后細胞的遷移情況。

1.6 Transwell 實驗檢測細胞侵襲能力 基質膠（美國BD公司）包被的Transwell 小室（美國Millipore 公司）放入24 孔培養板中，以5×104細胞/孔的密度，將U251 細胞接種至上室，孔徑為8 μm 的濾膜將上室的細胞和下室的培養液隔開。各組行相應處理，以無血清培養基培養24 h 后，將位于濾膜上層的細胞擦除，穿過濾膜，位于濾膜下部的細胞用龍膽紫（美國Sigam公司）染色后，倒置顯微鏡觀察。

1.7 腦膠質瘤裸鼠原位移植瘤模型的建立及實驗分組 取100只雄性BALB/c裸鼠[3～4周齡，（14±2）g，斯貝福生物技術有限公司]，參照文獻[13，14]在鼠立體定向儀（西安光學儀器廠）輔助下，通過微量進樣器，將1×106個U251細胞（2 μl）注射到右側紋狀體，建立荷瘤動物模型。7 d 后將裸鼠隨機分為對照組、Bev組、HBO 組和Bev+HBO 組，每組25 只。對照組經腹腔脈注射PBS，3 次/周，連續2 周；Bev 組腹腔注射Bev（5 mg/kg，3 次/周，連續2 周；HBO 組接受HBO 治療，1 次/d，連續2 周；Bev+HBO 組同時接受Bev 和HBO處理2周。

1.8 小鼠存活時間分析 每組取10只小鼠，記錄小鼠存活時間。

1.9 腫瘤體積的評估 造模后21 d，每組取5 只裸鼠采用CO2窒息法處死，參照文獻[16]，將小鼠腦組織從瘤細胞接種處一分為二，包埋后連續切三張切片，進行HE 染色（圖1），使用NIS-Elements 軟件（日本尼康公司）計算每張圖像中腫瘤面積，并取平均值，將瘤組織估算成一個球形，計算腫瘤組織的半徑r，按公式4πr3/3計算腫瘤體積。

圖1 HE染色測定荷瘤裸鼠腫瘤體積

1.10 微血管密度（micro vessel density，MVD）的測定造模后21 d，每組取5 只裸鼠，多聚甲醛灌注固定后分離腫瘤組織，冰凍切片后，采用采用SP 法進行CD34 免疫組織化學染色，按試劑盒（北京中杉金橋生物技術有限公司）說明操作。參照Weidner等[17]報道方法測定MVD，高倍鏡下（×200）計數CD34 陽性細胞數，單位為個/HP。見圖2。

圖2 CD34免疫組化染色測定荷瘤裸鼠微血管密度（×200）

1.11 qPCR檢測腫瘤組織MMP9 mRNA的表達 造模后21 d，每組選取5 只裸鼠采用CO2窒息法處死，獲取顱內腫瘤組織，使用TRIzol 試劑（日本TaKaRa 公司）提取總RNA。使用逆轉錄系統（日本Toboyo 公司）逆轉錄成cDNA。qPCR 使用SYBR Premix EX Taq 試劑盒（日本TaKaRa 公司）和ABI PRISM 7300 qPCR 系統（美國Applied Biosystems 公司），以GAPDH為內參，重復三次。采用2-ΔΔCT法量化分析。

1.12 統計學分析 采用SPSS 19.0 進行分析；定量資料用表示，采用方差分析和q檢驗；非正態分布定量資料采用Kruskal-Wallis H檢驗；P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Bev 的作用濃度 0、2、4、6 mg/ml 的Bev 處理U251 細胞，細胞增殖能力無明顯差異（P＞0.05，圖3）；8、10 mg/ml的Bev處理U251細胞，細胞增殖能力明顯下降（P＜0.01，圖3）。因此，選用6 mg/ml 的Bev進行后續實驗。

圖3 貝伐珠單抗作用U251細胞最佳濃度的確定

2.2 HBO 聯合Bev 對U251 細胞增殖能力的影響 與對照組相比，Bev 組U251 細胞增殖能力無明顯變化（P＞0.05，圖4）；與對照組或Bev 組相比，HBO 組U251 細胞增殖能力明顯下降（P＜0.01，圖4）。與HBO 組相比，HBO+Bev 組U251 細胞增殖能力明顯下降（P＜0.05，圖4）。

圖4 HBO聯合Bev對U251細胞增殖能力的影響

2.3 HBO聯合Bev對體外培養U251細胞遷移和侵襲能力的影響 與對照組相比，Bev組U251細胞遷移和侵襲能力均明顯增加（P＜0.01，圖5、6），而HBO 組U251 細胞遷移和侵襲能力均明顯下降（P＜0.01，圖3、4）；與Bev 組相比，Bev+HBO 組U251 細胞遷移和侵襲能力明顯下降（P＜0.01，圖5、6）。與HBO 組相比，Bev+HBO 組細胞遷移和侵襲能力均無明顯變化（P＞0.05，圖5、6）。

圖5 HBO聯合Bev對U251細胞遷移能力的影響

圖6 HBO聯合Bev對U251細胞侵襲能力的影響

2.4 HBO 聯合Bev 荷瘤裸鼠存活時間的影響 對照組、Bev 組、HBO 組、Bev+HBO 組荷瘤裸鼠中位生存時間（四分位間距）分別為：22（18～27）d、24（20～31）d、23（21～30）d、32（29～39）d。與對照組相比，Bev 組和HBO組荷瘤小鼠的生存時間延長，但無統計學差異（P＞0.05）。與對照組、HBO 組或Bev 組相比，HBO聯合Bev組荷瘤裸鼠的存活時間明顯延長（P＜0.01）。

2.5 HBO 聯合Bev 荷瘤裸鼠腫瘤體積的影響 對照組、Bev 組、HBO 組、Bev+HBO 組荷瘤裸鼠的腫瘤體積分別為：（32.47±2.09）mm3、（27.51±4.76）mm3、（26.78±4.24）mm3、（16.27±3.03）mm3。與對照組相比，Bev組和HBO組荷瘤小鼠的腫瘤體積縮小，但無統計學差異（P＞0.05）。與對照組、HBO 組或Bev 組相比，HBO+Bev 組荷瘤小鼠的腫瘤體積明顯縮小（P＜0.01）。

2.6 HBO 聯合Bev 荷瘤裸鼠腫瘤體積的影響 對照組、Bev 組、HBO 組、Bev+HBO 組荷瘤裸鼠的腫瘤MVD 分別為：（40.17±7.68）個/HP、（28.50±7.06）個/HP、（35.50±5.17）個/HP、（26.17±6.11）個/HP。與對照組相比，Bev 組和HBO+Bev 組MVD 明顯減少（P＜0.05），HBO 組MVD 無明顯變化（P＞0.05）；Bev 組與HBO+Bev組MVD無統計學差異（P＞0.05）。

2.7 HBO 聯合Bev 荷瘤裸鼠腫瘤MMP9 mRNA 表達的影響 與對照組相比，Bev 組MMP9 mRNA 表達水平明顯增加（P＜0.01，圖7），HBO 組MMP9 mRNA 表達水平明顯下降（P＜0.01，圖7）；與對照組和Bev 組相比，HBO+Bev 組MMP9 mRNA 表達水平明顯下降（P＜0.01，圖7）。與HBO 組相比，HBO+Bev 組MMP9 mRNA表達水平無明顯變化（P＞0.05，圖7）。

圖7 HBO 聯合Bev 對荷瘤裸鼠腫瘤組織MMP9 mRNA 表達水平的影響

3 討論

GBM 屬于血管形成極為活躍的實體瘤，VEGF在血管形成中發揮重要作用，GBM 組織VEGF 呈高表達。理論上，VEGF 單克隆抗體Bev 對GBM 有一定的治療效果。實際上，Bev 聯合替莫唑胺和放療明顯延長新診斷的GBM病人無進展生存期，顯示了Bev在膠質瘤治療領域的潛力。然而，Bev可誘導增強膠質瘤細胞侵襲性，并使病人病情迅速惡化，在臨床應用中并不能明顯延長病人總生存期。如果克服Bev導致的腫瘤細胞侵襲性增強，并增強Bev對腫瘤細胞的抑制作用，對增強Bev的治療效果有利。

本文結果顯示HBO 明顯抑制Bev 導致的U251細胞侵襲性增強。以往大量研究顯示MMP9在腫瘤細胞的侵襲和轉移中發揮重要作用，并與腫瘤細胞增殖能力相關[15]。MMP9 的表達水平隨膠質瘤病理分級的增高而增加，與GBM 的侵襲性、增殖能力以及病人不良預后有著密切的關系；抑制MMP9，腫瘤細胞的侵襲和增殖能力明顯下降。HBO 可明顯抑制缺血腦組織、脊髓損傷組織、糖尿病足、損傷血管組織MMP9 的表達，還可下調腫瘤細胞MMP9 的表達，抑制腫瘤細胞的浸潤與轉移[8，9，18]。本文結果顯示，HBO明顯抑制Bev導致的MMP9表達上調，提示MMP9 在HBO 抑制Bev 導致的U251 細胞侵襲性增強中發揮重要作用。

回顧性分析及薈萃分析顯示HBO 可導致腫瘤細胞凋亡、抑制腫瘤細胞分裂增殖。本文結果顯示，與單獨HBO或Bev相比，二者聯合應用使U251細胞的增殖能力明顯下降，荷瘤裸鼠的腫瘤體積明顯縮小，存活時間明顯延長，提示HBO 與Bev 聯合應用，可產生協同效應，共同抑制GBM 生長。本文還發現，Bev可降低腫瘤組織MVD，但不能延長荷瘤裸鼠的存活時間，與臨床應用Bev 治療GBM 的結論一致。HBO 對腫瘤組織MVD 沒有影響，聯合應用Bev與HBO，與單獨使用Bev 相比，腫瘤組織MVD 未見明顯變化，但腫瘤體積縮小，荷瘤裸鼠存活時間明顯延長，提示HBO增強Bev對膠質瘤細胞的抑制效果，與腫瘤組織內血管形成的關系不大，其中涉及的機制有待進一步研究分析。

既往研究顯示，HBO 可增強化療藥物的敏感性，改善膠質瘤的放療抗性，抑制膠質瘤干細胞增殖，并促進膠質瘤病人術后神經功能恢復，因此將HBO作為膠質瘤輔助治療的方法，值得深入研究。

總之，HBO 可抑制Bev 導致的膠質瘤細胞侵襲性增強，又能增強Bev對膠質瘤細胞的抑制作用，將HBO與Bev聯合應用，有助于增強Bev的治療作用。