人腦膠質瘤lncRNA PIK3CD-AS2表達及臨床意義

鄭江林 王 旋 汪珉杰 姜曉兵

膠質瘤是中樞神經系統最常見的原發性惡性腫瘤，具有難治療、易復發、生存期短的特點[1～3]，特別是膠質母細胞瘤，中位生存期僅8 個月左右[4]。近年來，膠質瘤潛在的分子生物學標志物成為研究的重點。長鏈非編碼RNA（long-coding RNA，lncRNA）是一類長度大于200 個核苷酸的非蛋白編碼轉錄子，通過染色質修飾、轉錄修飾和轉錄后修飾等參與基因的表達調控，與腫瘤細胞的增殖、侵襲、代謝、耐藥等緊密相關[5，6]。本文探討lncRNA PIK3CD-AS2在人腦膠質瘤中的表達情況及臨床意義。

1 資料與方法

1.1 公共數據庫檢索 檢索TCGA 數據庫（https://portal.gdc.cancer.gov/）下載膠質瘤組織RNA測序數據及對應的臨床數據。納入標準為：①總生存期≥30 d；②WHO 分級明確；③IDH 突變、1p19q共缺失和MGMT 啟動子甲基化數據完整。最終納入符合標準的膠質瘤共531 例。檢索GTEx 數據庫（https://gtexportal.org/）下載1 152例正常腦組織的RNA測序數據作為對照。所有RNA 測序數據經過統一的標準化處理。

1.2 臨床病例 收集2010 年9 月至2015 年6 月手術切除的原發性膠質瘤標本127例，其中男84例，女43例；年齡19～76 歲，平均（45.14±11.50）歲；WHO 分級Ⅱ級45例，Ⅲ級55例，Ⅳ級27例。所有病人均為首次手術且術前未行放化療，術后均隨訪至2020 年6月或直至死亡。另收集2018 年1 月至2019 年10 月顱腦損傷內減壓術中切除的正常腦組織標本38 例作為對照，其中男22 例，女16 例；年齡24～69 歲，平均（44.24±11.53）歲。本研究由華中科技大學同濟醫學院研究倫理委員會批準。

1.3 臨床病例的lncRNA PIK3CD-AS2 的提取及檢測 采用Trizol 提取總RNA，測定RNA 純度和濃度，應用逆轉錄試劑盒（Takara RR036A）逆轉錄成cDNA，qRT-PCR 采用TB Green Premix Ex TaqⅡ（Takara RR820A），檢測lncRNA PIK3CD-AS2 表達水平。引物序列：PIK3CD-AS2 正義鏈5'-GGGATCATAAATGCTTGCTGTT-3'，反義鏈5'-CGTATTAGTTACTGGTTGCTGTT-3'；內參GAPDH 正義鏈5'-GGTGAAGGTCGGAGTCAACG-3'，反義鏈 5'-TGGGTGGAATCATATTGGAACA-3'。采用2-△△Ct法進行相對定量分析，每個組織樣品實驗重復3次。

1.4 統計學分析 應用SPSS 25.0軟件分析；定量資料以表示，采用t檢驗；定性資料采用χ2檢驗和Fisher 確切概率法檢驗；Kaplan-Meier 法繪制生存曲線，采用Log-rank 檢驗；多因素Cox 風險回歸模型分析預后影響因素；P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 公共數據庫分析結果 與正常腦組織（GTEx；n=1 152）相比，膠質瘤組織（TCGA；n=531）lncRNA PIK3CD-AS2 表達水平顯著升高（P＜0.001；圖1）。膠質瘤WHO 分級越高，PIK3CD-AS2 表達水平明顯增高（P＜0.001；圖1）。

圖1 檢索TCGA和GTEx數據庫分析膠質瘤組織與正常腦組織lncRNA PIK3CD-AS2的表達情況

以PIK3CD-AS2表達水平中位數為界，將TCGA中531 例膠質瘤分為高表達組（265 例）和低表達組（266例）。多因素Cox風險回歸模型分析顯示，年齡增大、WHO 高級別以及PIK3CD-AS2 高表達是膠質瘤預后不良的獨立危險因素（P＜0.001，圖3），而IDH突變和1p19q共缺失是膠質瘤預后較好的獨立保護因素（P＜0.05，圖2）。生存曲線分析顯示，高表達組總生存期較低表達組顯著縮短（P＜0.001；圖3）。

圖2 檢索TCGA數據庫應用多因素Cox比例回歸風險模型分析膠質瘤預后影響因素

圖3 檢索TCGA 數據庫應用生存曲線分析PIK3CD-AS2 表達水平與膠質瘤病人總生存期的關系

2.2 臨床病例分析結果 與正常腦組織相比，膠質瘤組織lncRNA PIK3CD-AS2 表達水平顯著升高（P＜0.0001）。隨膠質瘤WHO分級升高，PIK3CD-AS2表達水平也明顯增加（圖4）。以PIK3CD-AS2 表達水平中位數為界，將127例膠質瘤分為高表達組（63例和）低表達組（64 例）。多因素Cox 風險回歸模型分析顯示例，WHO 高級別以及PIK3CD-AS2 高表達是膠質瘤預后不良的獨立危險因素（P＜0.001；表1）。生存曲線分析顯示，高表達組總生存期較低表達組顯著縮短（P＜0.001；圖5）。

表1 臨床收集的127例膠質瘤生存預后影響因素的Cox比例回歸風險模型分析

圖4 臨床檢測125例膠質瘤lncRNA PIK3CD-AS2表達水平

圖5 生存曲線分析臨床收集的127 例腦膠質瘤lncRNA PIK3CD-AS2表達水平與病人總生存期的關系

3 討論

膠質瘤為中樞神經系統最常見的原發性惡性腫瘤，難以完全切除，術后易復發，預后極差，因此，尋找膠質瘤潛在的分子生物學標志物具有重要意義。Wu 等[7]發現lncRNA DUXAP10 通過HuR/Sox12 信號軸維持膠質瘤細胞的干細胞特性。Cai 等[8]發現lncRNA LINC0098能夠通過CBX3介導的c-Met/Akt/mTOR 信號軸抑制膠質瘤細胞增殖。這表明，lncRNA參與膠質瘤的發生與發展過程。

lncRNA PIK3CD-AS2位于染色體1p36.22，大小為953 bp。Zheng 等[9]研究發現PIK3CD-AS2 在肺腺癌中高表達，并且通過PIK3CD-AS2/YBX1/p53信號軸促進肺腺癌細胞增殖。本文首先檢索公共數據庫進行生信分析，結果發現與正常腦組織比，膠質瘤組織lncRNA PIK3CD-AS2顯著高表達，并且隨膠質瘤WHO分級的升高，PIK3CD-AS2的表達也明顯增加。這提示PIK3CD-AS2與膠質瘤的發生和惡性進展存在一定的關系。同時，本文還發現PIK3CD-AS2 高表達病人總生存期顯著低于低表達病人。為驗證數據庫檢索結果的可靠性，我們收集127 例臨床膠質瘤病例進行分析，結果與公共數據庫檢索結果相符，進一步證實了PIK3CD-AS2作為膠質瘤分子生物學標志物的價值。

總之，lncRNA PIK3CD-AS2 在膠質瘤中高表達，可作為膠質瘤病人預后生物學標志物。