miR-126表達水平及其基因啟動子甲基化狀態與膠質母細胞瘤術后復發的關系

王艷新 葉富躍 王 艷

膠質母細胞瘤（glioblastoma，GBM）是最常見和最具侵襲性的原發性惡性腦腫瘤[1]，即使采用手術聯合術后放化療，預后仍很差。因此，探討其生物標志物對其臨床診治具有實際的臨床意義。研究發現miR-126在多種腫瘤中表達失調[2]。本文探討miR-126表達水平及基因啟動子甲基化狀態與GBM術后復發的關系。

1 資料與方法

1.1 標本來源 納入標準：①符合原發性GBM（WHO分級Ⅳ級）診斷標準[3]；②臨床資料完整；③手術前后影像學資料完整，術前沒有接受放療或化療；④均接受顯微手術，術后常規綜合治療。排除合并其他惡性腫瘤或自身免疫性疾病、心力衰竭、慢性阻塞性肺病、肝功能不全、腎衰竭。

收集2016 年8 月到2020 年12 月手術切除的石蠟包埋的GBM 組織標本86 例，其中男41 例，女45例；年齡25～83 歲，中位年齡51.0 歲；術前KPS 評分56～92 分，中位評分70.0 分。另選擇顱腦損傷內減壓術中切除非腫瘤腦組織30例，其中男15例，女15例；年齡23～85歲；中位年齡52.0歲。本研究經我院倫理委員會批準。

1.2 實時熒光定量PCR 法檢測miR-126 水平 使用QIAamp DNA/RNA FFPE組織提取試劑盒（德國QIAGEN 公司）提取石蠟包埋組織基因組DNA/RNA[4]。將總RNA 樣本依照RevertAid FirstStrand cDNA 合成試劑盒（美國Thermo Scientific 公司）和基因特異性環狀引物進行逆轉錄反應，反應條件：將混合物在冰浴上孵育5 min，42 ℃60 min，70 ℃5 min。用ABI 7500 實時PCR 系統（美國Applied Biosystems 公司）進行PCR 擴增（擴增條件：94 ℃10 min，95 ℃15 s，60 ℃60 s，40次循環，反應體積25 μl）。用2-ΔΔCt法以β-actin 為內參計算miR-126 mRNA 的相對表達量。數據用RNU6 標準化。miR-126 正向引物5'-TGCCTCGTACCGTGAGTAC-3'，反 向 引 物5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3'。

1.3 miR-126 甲基化狀態檢測[4]①取1 μg 組織總DNA，使用EZ DNA 甲基化試劑盒-Gold（北京中西遠大科技有限公司）進行亞硫酸處理。用Wizard DNA 純化樹脂對修飾后的DNA 樣本進行純化。②取200 μg 修飾后DNA 樣本進行甲基化特異性PCR（methylation-specific PCR，MSP）擴增。將PCR 產物經2.0%瓊脂糖凝膠電泳分離，溴化乙錠染色觀察。用Sssl 甲基化酶處理基因組DNA 作為甲基化DNA的陽性對照，用外周血單個核細胞DNA作為非甲基化基因的陽性對照。甲基化引物出現陽性擴增視為甲基化，否則為非甲基化。miR-126-M正向引物5'-TTG GCG GTC GGG TTT GGT C-3'，反 向 引 物5'-TAA AAC CCC GCG ACG AAC G-3'。miR-126-U正向引物5'-TTG GTT TTT GGT GGT TGG GTT TGG TT-3'，反 向 引 物5'-CAA ACA AAA AAA CTA AAA CCC CAC AAC AAA CA-3'。③變性高效液相色譜法檢測：分別取8 μl miR-126-M 擴增產物和miR-126-U 擴增產物以分離方式置于DNASep 核酸分析柱（美國Transgenomic 公司）中，收集更多的片段。采用Navigator軟件對結果進行分析（設置：碎片大小100～200 bp，分析溫度50 ℃，流速0.9 ml/min，紫外檢測波長260 nm）。

1.4 臨床和影像學隨訪 術中觀察肉眼全切除（Simpson 分級Ⅰ～Ⅱ級），次全切除（Simpson 分級Ⅲ級）。隨訪至2021 年3 月，隨訪時間2～56 個月，中位隨訪時間24.0 個月。術后72 h 內進行增強MRI 掃描，出院后前1 年每間隔3 個月、術后1～3 年每間隔6 個月、術后3年后每間隔1年，或出現如癲癇、神經功能障礙、顱內高壓等癥狀時復查增強CT 或MRI，觀察腫瘤情況。自術后至復查增強CT 或MRI 掃描時觀察到新增強病灶的時間為復發時間。腫瘤復發包括原位復發、鄰近部位復發或遠隔部位復發。

1.5 統計學處理 采用SPSS 21.0軟件處理；定量資料用表示，用t檢驗；多因素Cox回歸分析復發的危險因素；生存曲線分析miR-126 甲基化與術后復發時間的關系；繪制受試者工作特性（receiver operating characteristic，ROC）曲線分析miR-126 水平預測術后復發的效能；P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 GBM 組織miR-126 表達水平和甲基化狀態 與非腫瘤腦組織相比，GBM 組織miR-126 表達水平明顯降低（P＜0.05），同時基因甲基化率明顯升高（P＜0.05）。見圖1和表1。

圖1 MSP-DHPLC法檢測miR-126基因啟動子的甲基化狀態

表1 GBM組組織miR-126表達水平和甲基化水平狀態

2.2 GBM組織miR-126表達水平和甲基化狀態的關系 甲基化組GBM 組織miR-126 表達水平（0.530±0.139）明顯低于未甲基化組（0.861±0.121；P＜0.05）。

2.3 GBM組織miR-126甲基化狀態和術后復發的關系 術后58 例（67.44%）復發。與未復發組相比，復發組GBM 組織miR-126 表達水平明顯降低（P＜0.05，表2），同時基因甲基化率明顯升高（P＜0.05，表2）。生存曲線分析顯示，miR-126 甲基化組中位復發時間（16.0個月）較非甲基化組（39.0個月）明顯縮短（P＜0.05，圖2）。

表2 miR-126水平和甲基化率與GBM復發的關系

圖2 生存曲線分析miR-126甲基化狀態與術后復發的關系

2.4 GBM術后復發的影響因素 單因素和多因素Cox回歸分析顯示，GBM組織miR-126甲基化和IDH1基因突變是GBM 術后復發的獨立危險因素（P＜0.05）。見表3。

表3 本文86例膠質母細胞瘤術后復發危險因素的Cox回歸分析結果

2.5 GBM組織miR-126表達水平預測術后復發的價值ROC 曲線分析顯示，GBM 組織miR-126 表達水平預測術后復發的曲線下面積為0.894（95% CI 0.837～0.950；P＜0.05），最佳截斷值為0.830，靈敏度和特異度分別為90.0%和75.6%。見圖3。

圖3 ROC 曲線分析miR-126表達水平預測膠質母細胞瘤術后復發的效果

3 討論

近年來，膠質瘤的治療方法取得了一定的進步，包括手術、放化療等，但是GBM病人3年內病死率仍然超過90%，這與術后復發關系密切[5]。為了預測GBM的臨床病程，需要更清楚地了解引起術后復發的生物學因素。本文發現GBM 組織miR-126 表達水平明顯下調，這與miR-126 基因啟動子區域發生超甲基化有關；而且miR-126甲基化是導致GBM術后復發的獨立危險因素。

miRNA 是一種小的非編碼RNA，調控多種mRNA 轉錄和轉錄后翻譯過程。miR-126 是一種可調節人巨核細胞生成的miRNA，并且在各種惡性腫瘤中普遍下調，因此，被認為是一種潛在的腫瘤抑制因子。有報道稱miR-126是內皮細胞生物學和腫瘤血管生成的重要參與者，是腫瘤發展的標志性事件[6]。Chen 等[7]發現高度惡性膠質瘤組織和U87MG 細胞miR-126 的表達普遍低于正常腦細胞；miR-126表達上調后，U87MG 細胞的增殖、遷移和侵襲活性則受到明顯抑制，凋亡率明顯增加；這與靶向抑制PTEN/PI3K/AKT 通路和MDM2-P53 途徑有關。Xu等[8]通過轉染miR-126 mimics 后發現，U87 和U251細胞的遷移能力明顯降低。本文發現GBM 組織miR-126 表達水平較非腫瘤腦組織普遍降低，尤其是復發組降低水平更明顯。這提示miR-126有望成為GBM診斷、治療和預后的新型生物標志物。

腫瘤細胞miRNA 的表達受到包括DNA 甲基化修飾在內的表觀修飾等多種機制的調控，而GBM具有廣泛的遺傳和表觀遺傳學異質性。表觀遺傳調控基因的突變已被確定為具有明顯臨床特征的神經膠質瘤亞型的關鍵驅動因素。Klughammer 等[9]報道原發性和復發性GBM 相匹配的DNA 甲基化的基因組圖譜，從而確定了DNA 甲基化和腫瘤復發、病人生存預后之間的聯系。表觀遺傳學的改變，如DNA啟動子區CpG 島的甲基化狀態，被認為是腫瘤早期和常見的事件，并在腫瘤進展中發揮重要作用。本文發現與非腫瘤腦組織相比，GBM 組織miR-126 基因異常甲基化率升高，這是導致miR-126 表達水平降低的重要原因之一。Verhaak等[10]基于TCGA數據庫分析GBM 基因序列突變譜，并確認TP53、EGFR、IDH1、PIK3R1、BRAF V600E、PTEN 等相關突變，大多數GBM 存在這些基因或信號通路異常情況。這提示這些分子可能是GBM 發生、發展的關鍵分子。本文結果顯示miR-126 基因甲基化和IDH1 基因突變是影響GBM 術后復發的獨立危險因素。這提示miR-126基因甲基化和IDH1基因突變一樣，都是與GBM復發相關的一個重要表觀遺傳學事件。

綜上所述，GBM 組織miR-126 表達水平普遍降低，這與其基因啟動子異常甲基化有關；miR-126基因高甲基化是GBM術后復發的獨立危險因素，對預測病人預后有一定的作用。