血漿外泌體miR-212、miR-132與顱腦損傷嚴重程度和Rotterdam CT評分的關系

龔銘杰 黃 煒 施振華 王君祥

顱腦損傷（traumatic brain injury，TBI）是目前導致成年人群意外死亡的主要原因之一[1]。顱腦CT是臨床診斷TBI的基礎。Rotterdam CT評分對預測TBI預后有一定的臨床價值[2]。炎癥反應是導致TBI 繼發性損傷的機制之一[3]。外泌體微小核糖核酸（microRNA，miRNA）可以通過模式識別受體（pattern-recognition receptor，PRR）參與炎癥反應[4，5]。研究發現miR-212/132 在中樞神經系統中呈高度表達，與突觸可塑性、記憶形成和神經突生長有關[6]。本文探討血漿外泌體miR-212、miR-132 水平與TBI病人損傷程度和Rotterdam CT評分的關系。

1 資料與方法

1.1 研究對象 前瞻性收集2019 年3 月～2020 年10月收治的TBI 共76 例，其中男43 例，女33 例；年齡18～79 歲，平均（48.70±14.32）歲；交通事故傷36 例，高空墜落傷18例，異物打擊傷9例，其他原因13例；輕型19例，中型35例，重型22例。排除合并阿爾茨海默病、帕金森病、腦部腫瘤或其他器質性腦綜合征等以及酗酒或濫用藥物病人。另外，選取我院體檢38例健康成年人作為對照，其中男21例，女17例；年齡18～78 歲，平均（49.80±15.91）歲。本研究獲得我院醫學倫理委員會批準。

1.2 血漿外泌體miR-212、miR-132 的檢測 收集全血樣本，2 h 內以3 000 轉/min 離心10 min（4 ℃），收集血漿-80 ℃保存備用。血漿解凍后，3 000 轉/min離心5 min，去除循環細胞或碎片。取上清液50 μl，加入外泌體提取試劑10 μl，4 ℃孵育30 min，然后室溫1 000 g離心10 min，使用緩沖液重懸沉淀，得到血漿外泌體。使用電鏡觀察外泌體提取情況。免疫印跡法鑒定外泌體表面特異性抗原表達[7]。

取200 μl 血漿外泌體樣本，用TRIzol 試劑提取總RNA，PrimeScript First-Strand cDNA 合成試劑盒（日本Takara公司）逆轉成cDNA。取2.0 μl的cDNA模板和cDNAs PrimeScript RT Master Mix 試劑盒（日本Takara 公司）進行PCR 反應：95 ℃、15 min，94 ℃、15 s，55 ℃、30 s，70 ℃、1 min，40 個循環。miR-212正向引物5'-GGCACCTTGGCTCTAGACTG-3'，反向5'-GTCGGTGGCCGTGACTG-3'。miR-132 正 向 引物5'-CGACCATGGCTGTAGACTGT-3'，反 向5'-GTCTCCAGGGCAACCGTG-3'。U6 和18S rRNA 作為內源性對照。用2-△△CT法計算相對表達量。

1.3 Rotterdam CT 評分 入院進行腦部CT掃描，用于Rotterdam CT 評分[8]。初始CT 圖像通過醫學圖像歸檔和通訊系統進行復閱，并由2位專家獨立完成Rotterdam CT 評分：①基底池受壓程度；②中線偏移度；③硬膜外血腫；④腦室內或蛛網膜下腔出血。

1.4 統計學方法 應用SPSS 21.0軟件分析；正態分布計量資料以表示，采用t檢驗；非正態分布計量資料采用Mann-Whitney U；計數資料采用χ2檢驗；采用相關系數分析相關性；P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 外泌體的鑒定結果 電鏡觀察外泌體呈圓形、橢圓形，具有完成的雙層脂質包膜結構，直徑在50～120 nm。免疫印跡法檢測發現CD9、CD63 和CD81膜蛋白表達陽性。見圖1。

圖1 血漿外泌體的鑒定

2.2 TBI 病人血漿外泌體miR-212、miR-132 的變化與對照組比較，TBI 組血漿外泌體miR-212、miR-132水平明顯降低（P＜0.001，表1）。

表1 TBI病人血漿外泌體miR-212、miR-132水平變化

2.3 TBI 病人血漿外泌體miR-212、miR-132 水平與損傷嚴重程度的關系 與輕型TBI比較，中、重型TBI組血漿外泌體miR-132 水平明顯降低（P＜0.05，表2）；與中型TBI比較，重型TBI血漿外泌體miR-212、miR-132水平明顯降低（P＜0.05，表2）。血漿外泌體miR-212（r=0.396）、miR-132（（r=0.716）水平與入院GCS評分呈明顯正相關（P＜0.001）。

表2 TBI 病人血漿外泌體miR-212、miR-132 水平與損傷嚴重程度的關系

2.4 TBI 病人血漿外泌體miR-212、miR-132 水平與Rotterdam CT評分的關系 血漿外泌體miR-212水平（r=-0.375）和miR-132 水平（r=-0.613）與Rotterdam CT評分呈明顯負相關（P＜0.05）。

3 討論

TBI 的腦損傷包含兩個過程：急性損傷以及急性損傷結束后的慢性期（包含神經炎癥、氧化應激、神經細胞凋亡等過程）。TBI 后，小膠質細胞被激活，釋放多種活性物質，包括外泌體[9]。外泌體具有較低的免疫原性，可以穿透多種生物屏障，同時攜帶大量的特異性分子，為體內的“通訊使者”[10]。研究表明，外泌體含有大量miRNA，為TBI的潛在生物標志分子[11]。動物實驗發現，miR-212/132在大腦中呈普遍高表達，其靶基因（PDCD4、Ptgs2 等）可通過影響內皮祖細胞的再生、影響血腦屏障、樹突形態以及膠質細胞的分化等過程參與神經系統疾病的發生[12]。miR-212、miR-132 都位于人類17 號染色體，具有一定的同源性，可以共同調控下游靶基因。Burek等[13]研究發現miR-212/132可抑制緊密連接蛋白，改變低氧條件下血腦屏障的通透性。Xu 等[14]發現，神經元分泌含miR-132的外泌體對維持腦血管的完整性具有重要作用。

Rotterdam CT 評分是臨床應用比較廣泛的評分系統，包含對中線移位、中腦基底池受壓、顱內出血的位置等多個影像學特征的評估，這些指標與顱內壓升高密切相關。基底池的受壓程度是預測TBI病人預后的重要因素，初次CT檢查時腦池缺失或不可見的病人，預后不良風險增加近4倍[15]。顯著的中線移位是TBI 手術治療的指征，中線移位還與許多神經后遺癥有關，中線移位是臨床評估TBI 嚴重程度的重要參數[16]。中線移位＞5 mm 的病人，手術的風險增大[17]。Rotterdam CT 評分還包含對腦出血情況的評估。李浩浩等[18]研究表明Rotterdam CT 評分增加與TBI 預后不良有關。我們發現TBI 病人血清外泌體miR-212、miR-132水平與Rotterdam CT評分呈明顯負相關，提示血清外泌體miR-212、miR-132 水平在一定程度上反映TBI 病人的腦部影像學特征。此外，術前GCS 評分也與TBI 病人的預后顯著相關[19]。本文結果顯示TBI 病人血清外泌體miR-212、miR-132 與術前GCS 評分呈明顯負相關。隨著TBI病情的加重，血漿外泌體miR-132、miR-212 水平明顯降低。因此，我們認為，血清外泌體miR-212、miR-132水平不僅能反映TBI病人腦部CT影像學特征，同時對病人短期預后預測也具有一定價值。

綜上所述，TBI 病人血漿外泌體miR-132、miR-212 水平明顯下降，并且隨著TBI 損傷程度加重和Rotterdam CT 評分增加而隨之降低。這提示血漿miR-132、miR-212可能是TBI潛在的生物標記物。