外周血miR-21、miR-155與自身免疫性肝病患者Th17/Treg的相關(guān)性研究

魏毅強(qiáng) 張志強(qiáng) 楊亞莉

（新鄉(xiāng)市第一人民醫(yī)院消化內(nèi)科，河南 新鄉(xiāng) 453000）

自身免疫性肝病起病初期多表現(xiàn)為嗜睡、乏力等輕微癥狀，部分患者可無(wú)自覺(jué)癥狀，患者極易忽視而延誤治療，逐漸發(fā)展為發(fā)熱、腹水及黃疸等，嚴(yán)重可繼發(fā)肝衰竭、肝癌等危及生命，故尋求特異性、相關(guān)性指標(biāo)，盡早診斷、治療十分必要。研究表明，乙型肝炎不同階段患者體內(nèi)輔助性T 淋巴細(xì)胞17（Helper T cell 17，Th17）和調(diào)節(jié)性T 淋巴細(xì)胞（Regulatory T cell，Treg）的平衡水平表現(xiàn)為不同程度的失衡狀態(tài)[1]，與自身免疫性疾病及肝臟疾病發(fā)生與發(fā)展有關(guān)，臨床可對(duì)其檢測(cè)作為疾病活動(dòng)度及病情的評(píng)價(jià)指標(biāo)。微小RNA 為一種有調(diào)控能力，可在細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定存在的非編碼短鏈RNA，各類疾病的進(jìn)展中均可發(fā)現(xiàn)相應(yīng)的微小RNA 參與。例如，潰瘍性結(jié)腸炎患者體內(nèi)出現(xiàn)微小RNA-155（MicroRNA-155，miR-155）表達(dá)上調(diào)，且與炎癥因子及Th17 的異常表達(dá)有關(guān)[2]；微小RNA-21（MicroRNA-21，miR-21）與自身免疫性疾病系統(tǒng)性紅斑狼瘡密切相關(guān)[3]。這兩種微小RNA 均表現(xiàn)出對(duì)自身免疫性疾病的高敏感性，然而臨床對(duì)于自身免疫性肝病患者疾病微小RNA 表達(dá)和其與患者Th17／Treg 表達(dá)失衡間的關(guān)系鮮有研究，故本研究試探討自身免疫性肝病患者miR-21、miR-155 表達(dá)水平與Th17/Treg表達(dá)平衡間的相關(guān)性，報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2018 年1 月至2019 年1 月我院收治的65 例自身免疫性肝病患者作為觀察組，其中男性27 例，女性38 例；年齡37～60 歲，平均年齡48.46±4.75 歲；體質(zhì)量指數(shù)（Body mass index，BMI）19.39-24.41 kg·m-2，平均BMI（20.35±3.43）kg·m-2；同時(shí)期選取我院65 例健康體檢者為對(duì)照組，其中男性30 例，女性35 例；年齡35～60 歲，平均年齡48.55±4.68 歲；BMI 19.40-24.62 kg·m-2，平均BMI（20.51±3.52）kg·m-2，兩組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），有可比性。

納入標(biāo)準(zhǔn)：觀察組患者均符合自身免疫性肝病的診斷標(biāo)準(zhǔn)[4]，兩組入組前未接受保肝等有相關(guān)治療；未合并嚴(yán)重精神或認(rèn)知疾??；經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)；患者及其家屬均知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：排除合并其他肝臟疾病者，合并肝腎功能不全、肝臟惡性腫瘤者，近期有免疫調(diào)節(jié)或抗病毒藥物服用史患者等。

1.2 檢測(cè)儀器

熒光定量PCR 檢測(cè)儀（型號(hào)：BTK-96，無(wú)錫百泰克生物科技有限公司）；實(shí)時(shí)熒光定量試劑盒（貨號(hào)：TL988，西安天隆科技有限公司）。流式細(xì)胞儀（型號(hào)：伯樂(lè)ZE5，伯樂(lè)生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品（上海）有限公司），總RNA 提取試劑盒（貨號(hào)：6998452，Norgen Biotek 公司），反轉(zhuǎn)錄試劑盒（貨號(hào)：ALH266-DWM，北京百奧萊博科技有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 分離血清

兩組患者均于入組后次日晨起（8:00 左右）空腹?fàn)顟B(tài)下，采集外周靜脈血5 mL，以3000 r·min-1的速度離心20 min 后取血清備用。

1.3.2 熒光定量PCR 測(cè)定miR-21 與miR-155 水平

提取總RNA，采用的反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄后獲得相應(yīng)cDNA 模板，使用qRT-PCR 儀對(duì)其進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)。反應(yīng)體系共20 μL，包含：2 μL cDNA 模板，10 μL SYBRR Mix Taq ll，0.4 μL ROX，下游及上有引物各0.8 μL，無(wú)菌雙蒸水6 μL；反應(yīng)步驟：95 ℃，33 s，1 循環(huán)；95 ℃，5 s；62 ℃，35 s，40 循環(huán)，各樣本均重復(fù)進(jìn)行3次，后以2-△△CT 法進(jìn)行miR-155 和miR-21 表達(dá)水平的計(jì)算。引物序列，miR-155（片段長(zhǎng)度76 bp）下游引物：5'-GCGACCTGTGAATTATCGAC-3'，上游引物：5'-TGCGTGCTACTGAGACCTAC-3'，miR-21（片段長(zhǎng)度73 bp）下游引物：5'-GCTGACAATCGTTGGTACGT-3'，上游引物：5'-AAAGATGTTCGGTCATCGAT-3'。

1.3.3 流式細(xì)胞儀測(cè)定外周血T 細(xì)胞水平

采用流式細(xì)胞儀測(cè)定外周血輔助性T 細(xì)胞（Th17）以及調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞（Treg），以CD4+IL-17 在CD4+T 細(xì)胞中百分比來(lái)表示Th17 水平，以CD4+CD25+Foxp3+細(xì)胞在CD4+T 細(xì)胞中百分比來(lái)表示Treg 細(xì)胞水平，計(jì)算Th17/Treg 的比值。

1.3.4 外周血Th17/Treg 和miR-155 及miR-21 間相關(guān)性

Th17/Treg 作為因變量，miR-155、miR-21 外周血水平作自變量，行多元線性回歸分析，評(píng)估其間相關(guān)性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)采用SPSS26.0 軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，采用獨(dú)立樣本t進(jìn)行檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以例或率（n（%））表示，采用χ2進(jìn)行檢驗(yàn)；相關(guān)性分析采用多元線性分析法；P＜0.05 提示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 外周血miR-21 以及miR-155 水平比較

觀察組患者miR-21 以及miR-155 水平明顯高于對(duì)照組（P＜0.05），見表1。

表1 外周血miR-21 及miR-155 比較（，n=65）

表1 外周血miR-21 及miR-155 比較（，n=65）

注：與對(duì)照組相比，*P＜0.05。

2.2 兩組外周血Th17 及Treg 細(xì)胞水平比較

觀察組Treg、Th17 外周血含量及Th17/Treg水平均較對(duì)照組顯著增加，差異顯著（P＜0.05），見表2 和圖1。

表2 Treg、Th17 及其平衡水平比較（，n=65）

表2 Treg、Th17 及其平衡水平比較（，n=65）

注：與對(duì)照組相比，*P＜0.05。

圖1 Th17 及Treg 流式細(xì)胞檢測(cè)圖（Q2 為相應(yīng)細(xì)胞所在區(qū)）

2.3 外周血Treg、Th17 細(xì)胞平衡和miR-155 及miR-21 含量間相關(guān)性

以外周血Th17/Treg 為因變量，miR-155 及miR-21 含量為自變量行多元線性回歸分析知，外周血miR-155 及miR-21 水平與Th17/Treg 比值呈正相關(guān)（rmiR-21=0.444，回歸系數(shù)miR-21=0.015，tmiR-21=2.386，PmiR-21=0.019，rmiR-155=0.363，回歸系數(shù)miR-155=0.018，tmiR-155=2.668，PmiR-21=0.009，均P＜0.05）。

3 討論

自身免疫性肝炎患者體內(nèi)存在免疫系統(tǒng)異常激活，其中活化的Treg 細(xì)胞合成、釋放大量轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1（Transforming growth factor，TGF-β 1）、白介素（Interleukin，IL）-10 等因子，Th17細(xì)胞則釋放大量IL-23、IL-6 及IL-17 等炎性因子。其中TGF-β1 可對(duì)miR-21-5p 的表達(dá)進(jìn)行調(diào)節(jié)，使機(jī)體大量產(chǎn)生miR-21，使后者對(duì)肝臟組織、細(xì)胞的凋亡及增殖過(guò)程調(diào)節(jié)加強(qiáng)，促進(jìn)肝臟的損傷過(guò)程。而IL-23、IL-6 及IL-17 等表達(dá)上調(diào)，可反饋性的使炎癥介導(dǎo)有關(guān)的miR-155 表達(dá)水平上升，miR-155 還可促進(jìn)抗原呈遞過(guò)程，對(duì)免疫過(guò)程相關(guān)因子釋放產(chǎn)生調(diào)節(jié)，進(jìn)一步影響其免疫過(guò)程。Th17/Treg 是反應(yīng)機(jī)體Treg 細(xì)胞和Th17 細(xì)胞抑制炎癥和促進(jìn)炎癥狀態(tài)平衡的重要指標(biāo)，有研究指出[5]：自身免疫性肝病患者外周血miR-155 水平和IL-6、IL-17 以及IL-10 含量呈正相關(guān)，miR-21 則與IL-23、IL-17 及IL-10 含量正相關(guān)，提示自身免疫性肝病患者miR-155 與miR-21 可通過(guò)破壞Th17/Treg 平衡調(diào)控相關(guān)炎癥因子表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)疾病的發(fā)生與發(fā)展，故臨床可通過(guò)炎癥控制或免疫調(diào)控等方式對(duì)患者Th17/Treg 失衡以及miR-155 與miR-21 異常高表達(dá)進(jìn)行糾正，最終達(dá)到疾病控制和預(yù)后改善效果。然而本研究對(duì)不同活動(dòng)度、不同分類的自發(fā)性肝病患者間的差異未進(jìn)行分析，后續(xù)需進(jìn)一步、全面研究進(jìn)行探討。

綜上，自身免疫性肝病患者體內(nèi)存在miR-21、miR-155 的上調(diào)和Th17/Treg 細(xì)胞平衡的失調(diào)，且前兩者與Th17/Treg 失衡水平密切正相關(guān)，臨床可從此入手改善預(yù)后及病情。