攜HE4 的納米相變卵巢癌造影劑在體內成像實驗研究#

張勁宜 方善鈺 周婧君

（1.萍鄉市婦幼保健院婦產科，江西 萍鄉 337300；2.重慶醫科大學重慶 400010）

卵巢癌其發病率為婦科惡性腫瘤第三，死亡率卻第一位[1]。但是本病I 期患者5 年生存率大于90%，而晚期僅為29%[2-3]。近年來，超聲分子影像學已成為國際研究焦點。目前的超聲納米分子造影劑可通過單乳法和碳二亞胺法制備，再通過冷凍干燥法使粒徑最小，而包裹全氟已烷（Perfluorohexan，PFH）的是聚乳酸-羥基乙酸共聚物(Poly-lactic-co-glycolic acid-cooh，PLGACOOH)高分子材料，穩定性較高，在高強度聚焦超聲(High intensity focused ultraso-und，HIFU)的輻照下，能使液相的PFH 造影劑轉變成氣相的超聲納米微泡分子造影劑，從而使超聲增強顯像[4]。聚乳酸-羥基乙酸共聚物（PLGA-COOH）通過化學作用連接特異性配體，形成穩定的化學鍵[5-6]。

HE4（Human epididymis protein4,HE4）又被稱作人附睪蛋白4[7]。有研究顯示，HE4 在婦女的卵巢癌組織中表達較高，在其他正常與不正常組織、系統中找不到[8-10]。將HE4 偶聯在納米造影劑表面，通過靶向能夠牢固地聚集在腫瘤細胞上并能從分子水平識別，從而液相變產生特異性增強顯像。此外，通過一定功率的HIFU 輻照和超聲波聲壓效應的作用，理論上能夠使液體的全氟已烷（Perfluorohexan，PFH）變為氣體，進而達到在超聲上能增強顯影效果。

基于以上認識，本研究先用聚乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA-COOH)、PFH、人附睪蛋白4-聚乙二醇-氨基（HE4-poly(Ethylene glycol)PEG-NH2）等通過單乳化法及碳二亞胺法，分散、溶解、離心制備得到人附睪蛋白4-全氟已烷-聚乳酸（HE4-PFHPLGA）納米高分子造影劑，確定HE4 與普通全氟已烷-聚乳酸（PFH-PLGA）造影劑同樣具有良好的鏈接性和穩定性后，在裸鼠體內驗證了HE4-PFHPLGA 用作卵巢癌靶向超聲造影劑的效果。

1 材料與方法

1.1 主要材料

PLGA-COOH（深圳市魅羅科技有限公司）、PFH（美國Sigma 公司）、HE4-PEG-NH2（重慶川東化工有限公司化學試劑廠）、德國 Ependorf公司旋轉蒸發儀（上海亞榮生化儀器廠）、DFY 型超聲圖像定量分析診斷儀（重慶醫科大學超聲影像實驗室）

1.2 HE4-PFH-PLGA 冷凍納米高分子造影劑的制備

用電子秤稱取 100 mg PLGA 加入5 mL CH2CL2溶液中，用塑料薄膜封口，攪拌直至完全溶解；加入60 μL PFH，輕輕振蕩10 s；將 20 mL 1.5% SC 溶液加入上述混合液中，高速分散均質機乳化5 min 后，置于冰箱中2 min；將燒杯放于旋轉蒸發儀上用磁力攪拌器攪拌3 h，最大量使CH2CL2揮發；雙蒸水洗滌3 次，離心收集微球；取5 mL 微球溶解在MES 緩沖液中；以EDC 與NHS 比為1:3，PLGA 與EDC 比為1:10 的比例先后加入微球溶液中，4 ℃振蕩孵育30 min；用MES 洗滌混合液去除未反應的EDC 與NHS；稱取10 mg HE4-PEG-NH2溶解在MES 緩沖液中并與上述所得PFH-PLGA 造影劑混勻，室溫振蕩孵化2 h，經雙蒸水洗滌、離心，得到HE4-PFH-PLGA納米高分子造影劑。選取制備好的HE4-PFHPLGA 納米高分子造影劑，置于冷凍干燥機中 3天，蒸發多余的水分，減少粒徑長度，再凍存于冰箱中。稱取5 mg 干燥之后的HE4-PFH-PLGA納米高分子造影劑，充分溶解在MES 緩沖液，沖洗離心直到濃度均為5 mg · mL-1HE4-PFH-PLGA納米高分子造影劑。

1.3 細胞培養及裸鼠接種分組

用含10%滅活小牛血清的McCoys5A 培養基培養OVCAR-3 細胞，置于37 ℃、5% CO2孵箱培養；每4 天傳代一次，取對數生長期細胞種植在18 只雌性裸鼠身上，直到長出15 mm 的移植瘤。將所有移植瘤裸鼠隨機分為3 組，每組6只，第1 組作為實驗組，第2 組和第3 組作為對照組。

1.4 HE4-PFH-PLGA 體內靶向性增強成像

第1 組移植瘤裸鼠通過尾靜脈注射200 μL HE4-PFH-PLGA 造影劑 (濃度為5 mg · mL-1)，6h后用HIFU 輻照 (10 W 6 min) 卵巢癌移植瘤部位觀察造影劑顯像；第2 組移植瘤裸鼠通過尾靜脈注射200 μL 非靶向PFH-PLGA 造影劑(濃度為5 mg · mL-1)，6 h 后用HIFU 輻照 (10 W 6 min) 卵巢癌移植瘤部位觀察造影劑顯像；第3 組移植瘤裸鼠通過尾靜脈注射200 μL HE4-PFH-PLGA 造影劑 (濃度均為5 mg · mL-1)，6 h 后在卵巢癌移植瘤部位直接觀察造影劑顯影。觀察HIFU 輻照前后卵巢癌移植瘤部位的造影顯影以及HE4-PFH-PLGA 聯合HIFU 成像對比。

1.5 統計學方法

所有數據應用SAS10.0 軟件進行統計學分析。計量資料以均數±標準差（）表示，采用兩獨立樣本t檢驗。P＜0.05 表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 HE4-PFH-PLGA 納米高分子造影劑的穩定性

完成HE4-PFH-PLGA 納米高分子造影劑的制備后冷凍干燥保存。普通光學顯微鏡下，HE4-PFHPLGA 納米高分子造影劑微球分布均勻，無團聚，單個微球的外觀圓形；室溫保存7 d 后，其外觀仍完整，分布均勻，無團聚，見圖1。

圖1 HE4-PFH-PLGA 納米高分子造影劑（×200 倍）

2.2 HE4-PFH-PLGA 體內靶向超聲成像

把靶向造影劑和非靶向造影劑分3 組注入卵巢癌移植瘤部位6 h 后，觀察到實驗組HE4-PFHPLGA 靶向高分子造影劑在HIFU 輻照下使微球轉變為微泡在超聲下回聲明顯增強（P ＜0.05），見圖2A、圖2B；其余的兩組對照組無明顯變化，見圖2C、圖2D、圖2E、圖2F。

圖2 HE4-PFH-PLGA 和PFH-PLGA 注入裸鼠在HFIU輻照前后圖片

3 討論

近年，超聲造影劑分子成像技術迅猛發展[11]。包裹PFH 的是PLGA-COOH 高分子材料，穩定性較高，所以在本實驗中HE4-PFH-PLGA，經過震蕩，孵化都能保持一周以內的微球狀態。且在HIFU 的輻照下，能使液相的PFH 造影劑轉變成氣相的超聲納米微泡分子造影劑[12-14]。氟碳液體的特性是可隨著溫度變化而變化，當外界溫度到達58℃時氟碳液體可以轉變為氣體[15-16]。當造影劑進入裸鼠體內可以避免體溫的影響從而達到造影效果。

本研究在卵巢癌移植瘤體內超聲影像實驗中,只有實驗組HE4-PFH-PLGA 高分子造影劑通過HIFU 一定功率輻照后才能使超聲顯像造影回聲增強，說明HE4-PFH-PLGA 在體內能有效靶向卵巢癌組織。這可能是因為偶聯HE4 的HE4-PFHPLGA 高分子造影劑納米微球能靶向卵巢癌移植瘤部位，并能有效聚集在腫瘤細胞表面。本研究中在卵巢癌移植瘤部位經過HIFU 輻照達到一定溫度后納米微球中的PFH發生液相變使超聲造影成像。而PFH-PLGA 高分子造影劑雖經過HIFU輻照，但其未攜帶靶向標記物，不能到達腫瘤細胞表面聚集，不能有HIFU 滯留熱效應而沒有超聲增強顯像。

綜上所述，本實驗成功制備卵巢癌靶向HE4-PFH-PLGA 高分子造影劑，基本性質穩定，對卵巢癌移植瘤組織細胞具有明顯靶向性，在體內經過HIFU 一定功率的輻照有良好的超聲造影增強效果。為人們尋找更高效的靶向聲學顯像卵巢癌提供新方法。