MCP-1和CD105在稽留流產患者蛻膜組織中的表達及意義

劉學 欒曉瑾 肖正華

稽留流產（missed abortion，MA）指胚胎或胎兒已死亡，仍然滯留在宮腔內，未能及時從陰道排出[1-2]。MA是妊娠早期的常見并發癥，在我國的發生率約為13.4%，且呈逐年遞增的趨勢[3]。MA發病因素復雜，目前研究認為其發生與染色體異常、生殖道感染、母體系統疾病、內分泌失調和解剖缺陷等有關。然而仍有30%的MA病因尚不明確[4]。近年來，有研究發現單核細胞趨化蛋白-1（monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1）作為重要的趨化因子，在胎盤中廣泛表達[5]。并且有研究指出當胚泡植入后MCP-1表達受抑，有助于胎盤的發育和妊娠的維持[6]。在復發性流產和反復著床失敗的發展過程中，MCP-1能夠將單核細胞募集到損傷和感染部位上，發揮促炎效應，從而導致不良結局[7]。胎盤的發育伴隨著滋養細胞的侵襲和子宮螺旋動脈的重塑，這一過程受一系列血管生成因子的調控。CD105作為血管生成的相關標志物之一，參與維持血管內皮細胞的穩定，在胎盤組織中也呈廣泛表達[8]。然而目前尚未有文獻報道MCP-1和CD105在MA中的作用。本研究通過檢測MA和正常宮內早孕要求終止妊娠者蛻膜組織中MCP-1和CD105的表達水平，探討MCP-1和CD105在MA發生、發展中的作用，為進一步研究MA的發病機制提供理論依據。

1 對象和方法

1.1 對象 選取2020年6至12月重慶醫科大學附屬永川醫院收治住院的10例MA患者作為MA組，選取同期收治住院的10例正常宮內早孕要求終止妊娠者作為對照組。MA組納入標準：（1）孕周7～13周；（2）年齡20～35周歲；（3）彩超檢查提示胚胎停止發育；（4）胚胎無染色體異常。對照組納入標準：（1）孕周 7～13 周；（2）年齡20～35周歲；（3）彩超檢查提示宮內妊娠，可見心管搏動。兩組排除標準：（1）伴有全身性或生殖道的感染；（2）既往有不良孕產史；（3）有心血管系統、免疫系統、肝腎功異常的患者；（4）妊娠期間應用保胎藥物。兩組對象年齡、孕周、孕次、產次比較差異均無統計學意義（均P＞0.05），見表1。本研究經重慶醫科大學附屬永川醫院醫學倫理委員會審批通過，所有對象均簽署知情同意書。

表1 兩組對象一般資料比較

1.2 主要儀器和試劑 FACSCanto Ⅱ流式細胞分析儀、電泳儀、制膠板、電泳槽、成像儀、Stain Buffer（批號：554657）均購自美國 BD公司；BCA試劑盒（批號：B00S001100）、Dulbecco's磷酸鹽緩沖液（DPBS，批號：G4200）、4%多聚甲醛溶液（批號：AR0211）均購自中國鼎國公司；FBS（批號：F8687）和膠原酶Ⅳ（批號：V900893）均購自美國Sigma公司；ficoll分離液（批號：17544652）購自美國 Cytiva公司；CD45-APC-Cy7（批號：B314603）、MCP-1-PE（批號：B193217）、CD105 抗體（批號：10010278）、山羊抗小鼠單克隆抗體（批號：SA00001-1）、DAB 顯色試劑盒（批號：PK10005）均購自美國Proteintech公司。

1.3 標本采集 術后立即收集兩組的蛻膜組織，使用預冷的0.9%氯化鈉溶液洗凈組織的血液，直至漂洗液呈無色，一部分蛻膜組織放入凍存管內，置于-80℃冰箱保存，用于行流式細胞術和Western blot檢測；一部分組織石蠟包埋后常溫保存，用于免疫組化染色。

1.4 蛻膜免疫細胞（decidual immunocyte，DIC）中MCP-1表達水平檢測 采用流式細胞術。兩組每例各取50 g蛻膜組織于EP管中剪碎，加入1 ml濃度為0.01 g/ml的膠原酶Ⅳ消化30 min。然后加入5 ml含有10%FBS和1%雙抗的完全培養基終止消化，用70 μm細胞過濾器過濾，收集沉淀細胞，然后使用5 ml DPBS重懸備用。另外準備一只15 ml離心管，將密度為1.077的5 ml ficoll分離液緩慢加入其中，再將準備好的細胞懸液緩慢覆蓋在ficoll分離液上。使用水平離心機以2 500 r/min離心15 min，在5 ml的位置可見一層云霧狀的液面則是所需DIC，緩慢將其吸出，離心后用Stain Buffer重懸，調整細胞濃度為1×106/ml。吸取100 μl上述細胞懸液放置于流式管中，分別加入CD45-APC-Cy7、MCP-1-PE流式熒光抗體各2.5 μl，然后避光孵育30 min，再用DPBS洗滌兩遍后，用DPBS重懸至500 μl，立即用流式細胞儀檢測。應用Flowjo軟件測定MCP-1陽性細胞的比例，并進行統計學分析。

1.5 蛻膜組織中CD105的定位及表達水平檢測 采用免疫組化法。分別取兩組蛻膜組織石蠟塊切片固定后做好標志，然后進行脫蠟和水化處理，再滴加 50 μl 10%BSA溶液于切片上，室溫孵育60 min進行封閉，然后將50 μl抗-CD105鼠抗稀釋液滴加在切片上 4℃孵育過夜。再用PBS洗滌后，向每個切片中添加100 μl二抗稀釋液（1∶500），并在 4 ℃下再次孵育 50 min，陰性對照組使用PBS代替一抗。最后使用DAB顯色，將所有切片用蘇木精復染，通過分級乙醇脫水并用中性樹膠封固。將制備好的切片置于顯微鏡下觀察，并且隨機選擇3個視野（×10）進行拍攝。使用Image J軟件測量每個視野CD105陽性信號的平均光密度值（average optical density，AOD），并進行統計學分析。

1.6 蛻膜組織中CD105表達水平檢測 采用Western blot法。分別取兩組每例蛻膜組織30 mg，嚴格按照BCA試劑盒測定蛋白濃度，然后置于-80℃冰箱內保存。分別配制10%分離膠和4%上樣膠，待膠凝固后，每孔加入30 μg蛋白，然后在100 V恒壓條件下進行跑膠，跑膠結束后，按照黑膠白膜的順序于轉膜液中組裝夾板，將組裝好的夾板放入轉膜槽中，以恒定電流250 mA轉90 min，轉膜結束后將膜放置在5%脫脂奶粉中封閉1 h，然后加入1∶1 000稀釋的鼠抗CD105單克隆抗體，4℃孵育過夜，再用TBST洗膜3次，接著用對應一抗種屬的二抗稀釋液（1∶1 000）敷育1 h后用TBST洗膜，最后用ECL發光檢測試劑盒進行化學發光檢測。使用Gel-Proanlyzer軟件進行灰度定量分析。

2 結果

2.1 兩組DIC中MCP-1表達水平比較 與對照組比較，MA組患者DIC中MCP-1陽性細胞比例明顯升高，差異有統計學意義[（36.27±3.98）%比（15.17±7.62）%，P＜0.05]，見圖 1。

圖1 兩組蛻膜免疫細胞（DIC）中單核細胞趨化蛋白-1（MCP-1）表達水平比較（a：兩組DIC中MCP-1表達的流式細胞圖；b：兩組DIC中MCP-1陽性細胞比例比較的柱狀圖，*P＜0.05；MA為稽留流產）

2.2 兩組蛻膜組織中CD105表達水平比較 免疫組化結果顯示，CD105在兩組蛻膜基質細胞的細胞質與細胞核中均有表達，見圖2a-b；與對照組比較，MA組患者蛻膜組織中CD105表達水平升高，差異有統計學意義（5.40±0.49 比 3.03±0.21，P＜0.05），見圖 2c。Western blot結果顯示，與對照組比較，MA組蛻膜組織中CD105蛋白表達水平升高，差異有統計學意義（3.38±0.29比2.29±0.42，P＜0.05），見圖 3。

圖2 兩組蛻膜組織中CD105的定位和表達水平[a：稽留流產（MA）組蛻膜組織免疫組化染色所見，×10；b：對照組蛻膜組織免疫組化染色所見，×10；c：兩組蛻膜組織中CD105平均光密度值（AOD）比較的柱狀圖，*P＜0.05]

圖3 兩組蛻膜組織中CD105蛋白表達水平比較（a：兩組蛻膜組織中CD105蛋白表達的電泳圖；b：兩組蛻膜組織中CD105灰度值比較的柱狀圖，*P＜0.05；MA為稽留流產）

2.3 兩組MCP-1陽性細胞比例與CD105蛋白表達水平的相關性分析 兩組MCP-1陽性細胞比例和CD105蛋白表達水平均呈正相關（r=0.931和0.940，均P＜0.01），見圖4。

圖4 兩組單核細胞趨化蛋白-1（MCP-1）陽性細胞比例與CD105蛋白表達水平的散點圖[a：稽留流產（MA）組；b：對照組]

3 討論

在胚胎植入過程中，子宮內膜受卵巢激素的調控，促進子宮內膜間質細胞轉變為較大圓形的蛻膜細胞，稱為蛻膜化。同時，具有侵襲性的絨毛外滋養層細胞（extra villous trophoblasts，EVTs），植入和浸潤至蛻膜化的子宮內膜中，促進螺旋動脈的形成和重塑，為生長中的胎盤和胎兒提供營養和氧氣[9]。蛻膜化是成功建立和維持妊娠必不可少的一環，蛻膜基質細胞現已被認為是胎盤的主要免疫調節細胞之一，具有調節滋養細胞侵襲，抵抗炎癥和氧化應激以及抑制母體局部免疫反應的獨特能力[10-11]。一旦蛻膜化障礙則會導致EVTs遷移和侵襲受損，使螺旋小動脈重塑不足，胎盤血流量減少，進而導致胎盤缺氧。同時，蛻膜基質細胞釋放各種胎盤因子，激活系統炎癥反應，最終導致一系列妊娠并發癥，如胎兒生長受限、先兆子癇和流產等[12-13]。本研究中所涉及的MCP-1和CD105是公認的與炎癥免疫和血管形成相關的關鍵分子，本研究通過檢測MA患者蛻膜組織中MCP-1和CD105的表達水平，從而為探究炎癥和血管形成在MA發生、發展中的作用提供理論依據。

母胎界面主要由來自母體的蛻膜和來自胚胎和胎盤的滋養細胞組成，作為半同種異源的胚胎，不被母體免疫系統排斥，依賴于DIC的免疫調控。母胎界面的DIC主要由NK細胞、巨噬細胞、T細胞和多種少數細胞類型（如樹突狀細胞、自然殺傷T細胞等）組成[14]。蛻膜NK（dNK）細胞是最大的細胞群，在妊娠早期占母體免疫細胞的50%～70%，dNK細胞具有維持蛻膜微環境穩態的多種功能[15]。目前已被證實，dNK細胞數量和功能的變化與妊娠并發癥有關，如流產、胎兒宮內生長受限和子癇前期等[16]。而MCP-1是子宮內NK細胞的有效引誘劑和激活劑，MCP-1的升高能激活和招募dNK細胞，使dNK細胞從它的自然保護作用轉變為類似于具有細胞毒性的NK細胞，釋放穿孔素和誘導滋養層細胞凋亡，導致流產[17]。此外，在胚泡植入的過程中，大量MCP-1由蛻膜巨噬細胞誘導釋放，從而進一步將單核細胞激活為巨噬細胞并招募至母胎界面，參與炎癥的發生[18]。蛻膜組織中MCP-1表達的升高可能促進促炎型巨噬細胞募集，進而分泌大量炎性細胞因子（如TNF-α、INF-γ和IL-1等），進一步增強MCP-1的表達，形成一個正反饋回路，最終導致不良妊娠結局[19-20]。本研究發現，MA組蛻膜組織中MCP-1的表達水平明顯高于對照組，提示MCP-1在MA中發揮重要作用。因此筆者推測蛻膜組織中MCP-1水平參與了母胎界面的免疫失衡，MCP-1水平升高，直接導致了dNK細胞活性的改變，使其發揮細胞毒性作用。同時，MCP-1還可能通過誘導蛻膜巨噬細胞數量和功能的改變，發揮促炎的作用，最終導致MA的發生。

EVTs入侵子宮蛻膜后，與dNK和蛻膜巨噬細胞之間相互影響。在EVTs的植入過程中，螺旋小動脈壁的平滑肌細胞和內皮細胞不斷降解，螺旋動脈從窄口徑、高阻力血管轉變為大口徑、低阻力血管，血液以較低的流速向絨毛間隙輸送，促進胎盤和胎兒的生長發育[21]。螺旋動脈發育障礙嚴重影響了胎盤和胎兒的發育，最終導致各種妊娠并發癥。有研究指出，在子癇前期患者的血清中觀察到CD105的表達水平顯著上調，高水平的CD105導致血管內皮功能障礙、血管收縮和免疫失調，從而對母體和胎兒產生不良影響[22]。CD105是轉化生長因子-β的跨膜輔助受體，能夠干擾TGF-β與其受體的結合，抑制內皮一氧化氮合酶對血管的擴張作用，導致血管生成障礙，最終影響胎盤發育[23]。目前已經發現CD105除了抗血管生成的作用外，也可以參與炎癥過程并調節免疫反應。CD105可以促進單核巨噬細胞的黏附和遷移，誘導促炎型的巨噬細胞分化，從而導致不良的妊娠結局[24]。本研究中，與對照組相比，MA組CD105的表達水平呈上調趨勢，差異有統計學意義。因此筆者推測，CD105可能通過抑制血管發育和誘導炎癥免疫反應來促進MA的發生。蛻膜組織中CD105表達水平上調，一方面證實了在MA患者中，存在胎盤血管發育障礙。另一方面，CD105作為炎癥的調控因子之一，同MCP-1一樣，也能導致促炎型巨噬細胞增多，加劇母胎界面的炎癥反應爆發，最終導致MA患者的胚胎死亡。同時相關性分析顯示，在蛻膜組織中，MCP-1和CD105呈正相關，這提示MCP-1和CD105兩者可能存在著相互作用，從而共同調控MA的發生，但這仍需要進一步研究。

綜上所述，本研究顯示MA患者蛻膜組織中MCP-1和CD105高表達。MCP-1表達水平的升高，促使DIC的數量和活性發生改變，從而導致母體界面的免疫失衡。同時CD105的上調，導致子宮螺旋小動脈形成和重塑障礙，使胎盤發育不良，最終導致MA的發生。探討MCP-1、CD105與MA的關系，有利于為研究MA的發病機制提供新的理論依據。