外周血Cryab聯合MRI檢測對視神經脊髓炎的診斷價值

黃敏 許超 黃華云 黃華棟 李冬輝

視神經脊髓炎（neuromyelitis optica，NMO）是一種免疫介導的以視神經與脊髓同時或相繼受累為主的中樞神經系統炎性脫髓鞘病變[1]。研究表明，NMO患者體內會伴隨出現 αβ-晶狀體蛋白（crystallin-αβ，Cryab）表達異常[2]。Cryab具有神經保護作用，當視神經出現病變，外周血中Cryab水平會發生明顯改變[3]。同時NMO患者常合并廣泛的腦部損害與異常，臨床常使用MRI檢測對其進行診斷評價[4]。雖然NMO患者在發病初期顱腦MRI圖像與正常人群沒有明顯差異，但隨著疾病發展可在顱腦部特定區域產生諸如“云霧樣”“鉛筆芯樣”等特定樣強化病灶，成為臨床鑒別和診斷NMO的重要依據[5]。而對于顱腦MRI的判定需要在掃描結束后由專業人員完成，以檢測顱腦病變情況。本研究通過分析NMO患者的外周血Cryab變化和MRI診斷信息，探討兩者對NMO的診斷價值。

1 對象和方法

1.1 對象 選取2019年1月至2020年2月長興縣人民醫院收治的NMO患者53例作為NMO組，所有患者均參照Wingerchuk等[6]發表的NMO診斷標準予以確診。其中男 18 例，女 35 例；年齡 18～60（45.14±12.71）歲；病程2 d～5年，平均（2.7±0.6）年。選取同期在本院門診進行健康體檢的健康志愿者50例作為對照組，其中男20例，女 30 例；年齡 19～58（44.22±15.42）歲。兩組研究對象性別和年齡比較差異均無統計學意義（均P＞0.05）。本研究經醫院醫學倫理委員會審批通過（IV-H3130000-011A），所有患者均知情同意。

1.2 主要試劑和儀器 總蛋白抽提試劑盒購自美國Hyclone公司；Cryab一抗購自美國BioLegend公司；羊抗兔二抗購自美國CST公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒購自美國Thermo公司；高效顯影膠片、顯影液、定影液購自德國柯達公司；ECL-Plus試劑及聚乙烯二氟（PVDF）膜購自美國Millipore公司；倒置顯微鏡購自德國Olympus生命科學公司；-80℃冰箱購自美國Thermo公司；高速離心機購自德國Eppendorf公司；CO2培養箱購自日本SANYO公司。

1.3 方法

1.3.1 外周血Cryab表達水平檢測 采用Western blot法。主要步驟如下：空腹狀態下，收集研究對象外周血作為樣本，采用總蛋白抽提試劑盒提取全血的蛋白質，并采用BCA定量法測定蛋白濃度。蛋白定量后，配置為1 μg/μl的蛋白溶液。配置濃縮膠、分離膠和緩沖液，以10 μl/孔的用量將蛋白溶液上樣于濃縮膠，運用濕轉法，90 V恒壓電泳80 min，電泳后，不同分子量的蛋白被分開。麗春紅染液確認分離效率，并將分離后的蛋白印跡電轉印至0.22 μm孔徑的PVDF膜，轉印條件為80 V×60 min。電轉印結束，5%的脫脂牛奶封閉非特異性抗體，加入一抗（3%的脫脂牛奶配置，濃度1∶2 000），4℃孵育過夜，次日，TBST 洗膜后加入二抗（濃度 1∶2 500），室溫孵育90 min。抗體孵育后采用ECL發光試劑盒顯色，初步觀察目的條帶，目的條帶清晰者轉入暗室進行膠片顯影，所得膠片掃描為灰度圖，并用圖像分析軟件Image J 6.0對圖像進行灰度分析。外周血Cryab的表達檢測委托杭州歐蒙未一醫學檢驗實驗室完成。

1.3.2 MRI檢查方法 采用1.5T MR掃描儀（荷蘭飛利浦公司）對患者顱腦進行MRI掃描分析。8通道頭顱正交線圈，橫斷面雙回波T2WI掃描。參數設置：TR：3 000 ms，TE：25/29 ms，ETL：8，NEX：2，矩陣：256×256。橫斷面、矢狀位、冠狀位液體衰減反轉恢復序列（FLAIR）T2WI掃描，參數設置：TR：9 600/1 718 ms，TE：100 ms，TI：2 400 ms，NEX：1，矩陣：256×192。橫斷面 FLAIR T1WI掃描，參數設置：TR：2 000 ms，TE：6.9 ms。將顱腦 MRI影像出現特定樣強化病灶判定為NMO陽性，然后計算MRI檢查對NMO診斷的靈敏度和特異度。

2 結果

2.1 外周血Cryab表達對NMO的診斷效能 NMO組患者外周血Cryab表達水平為0.825±0.251，高于對照組的 0.305±0.077，差異有統計學意義（P＜0.05）。典型樣品Western blot顯影見圖1。外周血Cryab表達對NMO的診斷價值相對較高，AUC=0.840，P＜0.01，最佳截點值為0.594，靈敏度為0.774，特異度為0.860，見圖2。

圖1 兩組研究對象外周血αβ-晶狀體蛋白（Cryab）表達的電泳圖[對照組1和對照組2為對照組的兩個典型樣品，視神經脊髓炎（NMO）組1和NMO組2為NMO組的兩個典型樣品]

圖2 外周血αβ-晶狀體蛋白（Cryab）表達診斷視神經脊髓炎（NMO）的ROC曲線

2.2 MRI檢測情況分析 MRI檢查顯示，NMO陽性36例，陰性67例；MRI檢查對NMO診斷的靈敏度、特異度分別為 0.679（36/53）、1.000（50/50），見表 1。圖 3 為 MRI檢查中典型的陽性結果，相比于正常的顱腦MRI，陽性結果會在顱腦特定區域出現“云霧樣”“鉛筆芯樣”強化病灶。

圖3 MRI檢查中典型的陽性結果圖（a：“云霧樣”強化病灶；b：“鉛筆芯樣”強化病灶）

表1 MRI檢測情況分析（例）

2.3 外周血Cryab聯合MRI檢測對NMO診斷的一致性評價 外周血Cryab聯合MRI檢查對NMO診斷的靈敏度、特異度分別為 0.755（40/53）、1.000（50/50），見表2。相比于單獨檢測，兩者聯合檢測的靈敏度與特異度均得到較大提高，且與臨床確診結果的一致性處于良好水平（Kappa=0.749）。

表2 外周血Cryab聯合MRI檢測情況分析（例）

3 討論

NMO又被稱為Devic綜合征，是由一組體液免疫參與的抗原-抗體介導的嚴重中樞神經系統特發性炎性脫髓鞘性疾病，發病過程中患者常常伴隨視神經炎和脊髓炎反復發作，由于臨床研究對NMO的認識不足，缺乏良好診斷的依據，導致患者臨床診斷與治療效果較差[7-8]。研究表明，早期有效診斷可以明顯降低NMO復發率和致殘率，對于治療NMO具有極大的意義[9]。

NMO發病過程中主要損傷中樞神經系統的星形膠質細胞[10]，對星形膠質細胞起保護作用的Cryab就成為一個研究熱點。Cryab是晶狀體中的主要蛋白成分之一，屬于小分子熱休克蛋白家族[11]，與多種眼科疾病如白內障[12]、NMO[13]等的發生與發展密切相關。研究Cryab在不同疾病中的表達狀態能為疾病預防和治療提供一定的理論依據[14]，相關研究顯示，視神經病變患者Cryab呈現出異常升高的狀態[15-16]，與本研究結果基本一致。此外，本研究結果顯示Cryab表達診斷NMO的靈敏度和特異度分別為0.774和0.860，進一步證實了其診斷學價值。由于NMO的發病過程中會伴隨感覺減退甚至消失、四肢乏力、行走困難等中樞神性系統病變的特征，顱腦局部病變也是NMO的一個重要發病征象，既往研究指出，NMO患者的神經病變主要集中在大腦皮質下及深部腦白質、脊髓束、胼胝體等與視神經相關的神經區域，病變形態大多數也呈現為斑片樣、點狀或類圓狀[17-18]。本研究結果也顯示NMO患者在MRI掃描中出現顱內、視神經內病灶的部分強化，因此需要對NMO患者進行MRI檢查輔助診斷[19]。本研究顯示MRI檢查對NMO診斷的靈敏度、特異度分別為0.679和1.000；根據特異度的表現，證實對于NMO的診斷，MRI檢查必不可少，能夠與其他疾病較好地區分開；但同時根據MRI檢查在靈敏度上的表現，說明對于NMO的診斷，單一的MRI檢查尚不足以滿足臨床診斷所需。因此本研究集兩者之優勢，考察了Cryab表達聯合MRI檢測對NMO的診斷效能，發現兩者聯合檢測的靈敏度和特異度分別為0.775和1.000。

綜上所述，外周血Cryab聯合MRI檢測能夠更加有效診斷NMO，對于早期有效診斷NMO具有極其重要的價值。同時兩者聯合檢測還能夠及時反映疾病發展情況，利于為疾病的治療提供更為科學的診斷依據，提升NMO患者的臨床診治水平。