2，6，9-三取代嘌呤衍生物三維定量構效關系和靶點相互作用

賈 磊，朱財盛，2，麥曦*，馮麗華，杜巧麗，何玲，何衛保，張其民

(1.南昌大學藥學院，江西 南昌 330006；2.中國科學院上海藥物研究所，上海 201203)

嘌呤是一類重要的生命活性物質，參與生物體內的新陳代謝過程、生命過程中的能量轉移、核酸合成以及多種生化反應，具有廣泛的生物活性，對嘌呤進行結構修飾改造后能獲得抗腫瘤、抗病毒及抗炎等多種活性的藥物[1]，如抗代謝物巰嘌呤和巰鳥嘌呤是傳統的抗腫瘤藥物[2-3]，嘌呤類核苷藥物奈拉濱、氟達拉濱、克拉利濱和克羅拉濱等均為廣泛用于臨床的癌癥治療藥物[4-5]。

對嘌呤母核的2，6，8，9位進行結構修飾發現了多種作用機制的嘌呤類衍生物，主要有細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑(cyclin dependent kinase,CDKs)[6-7]、熱休克蛋白90(Hsp90)抑制劑及DNA拓撲異構酶抑制劑等；其中的N,N-二甲基腺嘌呤(6-DMAP)是最早應用于臨床的嘌呤類CDKs抑制劑，而后進一步篩選得到Olomoucine，其對CDK1(IC50=7.0 μmol·L-1)、CDK2(IC50=7.0 μmol·L-1)和CDK5(IC50=3.0 μmol·L-1)都有抑制作用，對Olomoucine進行結構改造得到Olomoucine II，發現其對CDK1抑制活性顯著提高(IC50=0.1 μmol·L-1)[8]。Bukanov等[9]通過對Olomoucine II進行結構優化，設計合成出化合物R-CR8(IC50約為19.0 nmol·L-1)。Wu等[10]發現嘌呤類CDKs抑制劑Seliciclib對CDK1、CDK2、CDK5、CDK7都有很強的抑制作用，現已進入多項II期臨床研究。MPC-3100是Myriad Pharmaceutiicals Inc公司研發的嘌呤類Hsp90抑制劑，并于2011年完成了I期臨床試驗[11]；另一個嘌呤類Hsp90抑制劑Debio 0932已進入臨床II期試驗，其主要針對非小細胞肺癌的治療[12]。Barbara等[13]采用兩階段虛擬篩選的方法，分別從已建立的9-H嘌呤類和1H-吡唑并[3，4]嘧啶類拓撲異構酶IIa抑制劑中篩選出具有微摩爾級別抑制活性的新化合物，發現化合物13和22對人肝癌細胞(HepG2)和人乳腺癌細胞(MCF-7)顯示出良好的抗增殖活性。

定量構效關系(Quantitative Structure-Activity Relationship,QSAR)是一種借助化合物的理化參數或結構參數，以數學和統計學手段定量研究化合物結構與生物活性、化合物在生物體內吸收、分布、代謝、排泄等相關性質的方法。常用的方法有二維QSAR(2D-QSAR)和三維QSAR(3D-QSAR)方法，2D-QSAR通過計算分子的物理化學參數，建立理化參數與活性之間的線性模型或非線性模型后，用于新化合物的活性預測、篩選及設計[14]。3D-QSAR是建立在分子的三維結構與各類活性之間的關系，通過力場計算，建立分子體積、分子形狀、電荷分布與活性之間的關系，代表性的3D-QSAR方法有比較分子場分析法(Comparative Molecular Field Analysis,CoMFA)[15]與比較相似性指數分析法(Comparative Molecular Similarity Indices Analysis,CoMSIA)[16]等。易位體比較分子場法(Topomer CoMFA)是由Cramer等[17]基于二維片段分析開發的新型3D-QSAR工具,Topomer CoMFA模型是將化合物分子結構切割成若干個碎片，運用靶點篩選技術，用其他基團或者分子結構替換原分子結構中的某些碎片，利用搜集的活性數據進行分析，建立的模型可以基于原碎片的虛擬篩選以及對分子的官能團機構進行替換優化。與CoMFA和CoMSIA不同的是，Topomer CoMFA是通過疊合替換規則完成的3D-QSAR準備工作,具有重復性高的優勢，利用Topomer CoMFA可快速建立模型并進行分析與評價，為構建構效關系提供有利的理論依據。本文擬采用Topomer CoMFA研究2,6,9-三取代嘌呤類衍生物的3D-QSAR，并采用分子對接Surflex-dock法研究嘌呤類衍生物與CDK2的作用模式和作用機制，分析影響嘌呤類衍生物抗腫瘤活性的分子結構特征，建立具有顯著預測能力的嘌呤類化合物活性預測模型，為創新藥物的研究提供科學依據。

1 實驗部分

1.1 數據集來源和結構構建

本論文合成了45個2，6，9-三取代嘌呤類衍生物，，結構通式如圖1所示用MTT法測定所有化合物對非小細胞肺癌細胞A549的生長抑制作用，計算各化合物對腫瘤細胞生長抑制率，采用改良寇式法計算各化合物的半數抑制濃度IC50值(μmol·L-1)，所有IC50值均將單位轉化為mol·L-1，然后均轉化為負對數pIC50(=-lgIC50)。用SYBYL進行3D-QSAR建模和分子對接，使用Sketch Molecule模塊構建了所有化合物圖像的3D結構(表1和圖1)，利用Tripos力場和Gasteiger-Huckel電荷優化每個分子(創建訓練集，測試集和分子對接)，使用Powell梯度算法進行結構能量最小化，其收斂準則為0.005 kcal·mol-1，最大值為10 000次迭代。

表1 嘌呤衍生物分子結構和活性值a)

1.2 Topomer CoMFA模型的構建

將45個化合物隨機分組，36個化合物組成訓練集(80%)，9個化合物組成測試集(20%)。采用Topomer技術將化合物分子切割成幾個片段，并生成碎片三維結構，碎片根據一定的經驗規則進行調整后，進行Topomer CoMFA分析，計算分子的電性參數和立體參數，以電性和立體參數為自變量，pIC50為因變量，采用偏最小二乘法(Partial least squares,PLS)進行模型擬合，抽一法(Leave-One-Out)交互驗證檢驗模型的內部預測能力，測試集驗證模型的外部預測能力。

1.3 分子對接

采用Surflex-dock研究化合物與CDK2的作用模式和作用機制，CDK2三維晶體結構來源于PDB數據庫(http://www．rcsb．org/，登錄號1HCK)，為三磷酸腺苷(ATP)活性位點共晶結構，經提取ATP配體、去水、加氫等修飾后，以配體方式產生活性位點，設置Surflex-dock配體輸出構象個數為20個，其余參數默認，以原配體結構作參照對比，進行化合物與CDK2活性位點的對接及打分，以Total score為輸出構象的總打分函數。

2 結果與討論

2.1 Topomer CoMFA建模結果和評價

Topomer CoMFA建模過程中，斷裂方式的選擇對模型的質量影響較大，本研究中的嘌呤衍生物主要以6，9位取代為主，因此采用圖1所示對A鍵和B鍵進行3種方式的Topomer切割斷裂后，將化合物分為2個或3個片段，計算各片段的電性參數和立體參數，采用PLS通過交叉驗證得到最佳主成分數n后進行非交叉驗證回歸，建立了3個3D-QSAR模型(表2)；同時，得到交叉驗證系數Q2和非交叉驗證相關系數r2，預測值的標準誤差SD以及顯著性檢驗F。交叉驗證系數Q2越大，相關系數r2越大，SD值越小，表示相關性越好，模型的預測能力越強。而F主要用于判斷樣本間是否有顯著差別，其值越大，說明差別越顯著。對于TopomerCoMFA模型，一般Q2>0.5，r2>0.6，F>100,即表明所建模型具有較好的統計學意義和預測能力。

表2 Topomer CoMFA模型驗證結果a)

圖1 嘌呤衍生物結構及斷裂方式

Experimental pIC50

2.2 構效關系分析

化合物3結構較簡單，以該化合物為樣本分子做3D-QSAR分析。如圖3(A)所示，化合物3按表2模型1的的斷裂方式切割為Ra及Rb二個分子片段，圖3(B)和圖3(D)分別為Ra及Rb的立體場三維等勢圖，圖中綠色區域表示此處引入體積較大的取代基有利于活性的提高，而黃色區域表示此區域不宜有大體積的取代基，在圖3(B)中，嘌呤8位附近聚集了較大體積黃色等勢域，表明8位不宜引入取代基；9位取代基的中段和遠端聚集了大片綠色等勢域，表明引入較大體積取代基有利于化合物活性提高，如9位取代基為n=7碳鏈取代的化合物15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25的活性均高于相應的n=3碳鏈取代的相應化合物1，2，3，4，5，6，8，10，11，12，13，14，尤其是化合物24為活性最高的化合物；圖3(D)中，嘌呤6位取代基甲氨基處有體積較大的綠色區域，表明嘌呤6位可以引入體積較大取代基，因此用體積更大的丙胺和丁胺取代后生成的化合物4和5的活性逐漸提高。

圖3(C)和圖3(E)分別為Ra及Rb的靜電場三維等勢圖，圖中紅色等勢域表示引入負電性基團有利于化合物活性的增加，而藍色等勢域表示此區域可引入正電性基團；由圖3(C)可知，嘌呤2位取代基周圍被紅色等勢域所包圍，表明嘌呤2位宜引入負電性取代基，在本類化合物中，化合物28～44均為2位具有負電性氯取代基的衍生物，它們的活性與相應沒有氯取代的化合物相比有部分化合物活性有增加，如28，29，34分子與相對應在2位無氯取代基的1，2，13相比均增加了活性；但有的化合物引入氯取代基后活性降低了，如36，38，39分子與無氯取代基的15，25，18相比，活性均有所下降；這種現象與嘌呤環中雜原子氮對氯取代基影響有關，在鮑林電負性中氯的電負性大于氮的電負性，而在阿萊-羅周的電負性中卻是氮的電負性大于氯的電負性，即氮和氯的電負性是近似的，因此嘌呤2位的取代氯雖然為負電性，但對活性的影響并無規律性。由圖3(E)可知，Rb的近端和中端為紅色和藍色等勢域交錯，表明此區域可引入一些極性取代基，遠端為藍色等勢域，表明遠端宜引入帶正電取代基，此結果表明在嘌呤6位宜引入一些極性基團。

(A)化合物3的斷裂方式；(B)Ra的立體場等勢圖;(C)Ra的靜電場等勢圖;(D)Rb的立體場等勢圖;(E)Rb的靜電場等勢圖。

2.3 與靶點作用模式

腫瘤細胞中的細胞周期調控缺陷由CDKs/Cyclin失調直接或間接導致，即與Cyclin和CDKs過量表達或活性異常增強有關[19]。由于CDKs在調控腫瘤細胞增殖與凋亡中起關鍵作用，抑制CDKs可有效阻止癌細胞周期進程，從而抑制腫瘤細胞增殖[20]，研究嘌呤類衍生物對CDKs的作用模式可以探究其抗腫瘤作用機制，為其結構改造提供依據，本文采用Surflex-dock分子對接法研究了本類嘌呤衍生物與ATP的活性位點CDK2的作用模式與機制，ATP的活性位點共晶結構的PDB號為1HCK,是研究得最為深入的一個CDK亞型結構[21-22]，其活性結構主要分為絞鏈區、核糖/磷酸鹽結合區和Phe80口袋區，絞鏈區(殘基81-84)存在著一些氫鍵供體和受體的結合位點，其中最關鍵的為Leu83和Glu81，ATP的腺嘌呤環能夠與Leu83和Glu81同時形成氫鍵，一些強效的抑制劑CDKs抑制劑，如R-roscovitine、Purvalanol B和Olmoucine等都能與Leu83的羰基之間形成氫鍵[23];CDKs結構中有一個由Phe80形成的淺腔，雖然沒有被ATP占據，但是在一些抑制劑中都將疏水環伸向了該位點[22]；ATP中的磷酸基團能與CDKs晶體結構中的Lys33、Asp145作用，這一區域具有高度的親水性和柔性。對化合物進行設計時將該親水性區域加以考慮可能對提高化合物的活性和選擇性有幫助。圖4(A)和4(B)分別為高活性化合物24和低活性化合物1的氫鍵作用圖，化合物24嘌呤環的6位芳環取代基的羥基能夠與絞鏈區的Leu83和Glu81形成2個氫鍵，嘌呤環的5位N與核糖/磷酸鹽結合區的Lys33形成1個氫鍵，9-位長側鏈的酯基氧與Gln131形成第1個氫鍵；而化合物1僅形成2個氫鍵，分別為5位N與Asn132及9位側鏈?；跖cLys89形成，化合物1沒有與關鍵的氨基酸殘基Leu83和Glu81形成氫鍵，或許是其活性低于化合物24的原因之一，同時也與其6位僅為氯取代基有關，該結果表明在嘌呤6位宜引入能形成氫鍵的基團。圖4(C)和4(D)是為化合物24和化合物1在CDK2活性口袋中的鍵合模式圖，化合物24將嘌呤6-位取代的芳環伸向Phe80和Phe82形成的疏水腔，9位取代側鏈伸向Asp145處的親水腔；而化合物1則是將嘌呤9-位取代側鏈伸向疏水腔，6-位取代氯伸向親水腔。

圖4 化合物24(A)(C)和化合物1(B)(D)與CDK2鍵合模式圖(綠色虛線代表氫鍵)

3 結論

本文通過Topomer CoMFA方法成功建立了2，6，9-三取代嘌呤類衍生物的3D-QSAR模型，其交叉驗證系數為0.929，F檢驗值為100.35，外部交叉驗證系數為0.566，模型具有優良的預測能力；3D-QSAR模型表明，嘌呤9-位引入較大體積取代基有利于化合物活性提高；嘌呤2-位宜引入一些負電性取代基；2，6，9-三取代嘌呤類衍生物與CDK2靶點的作用模式進一步表明，嘌呤6-位如引入能形成氫鍵的取代基將有利于與CDK2絞鏈區的關鍵氨基酸殘基Leu83和Glu81形成氫鍵，因此綜合3D-QSAR模型和分子對接研究結果，嘌呤6-位引入較大體積并能形成氫鍵的取代基將有利于化合物活性的提高。