以大黃制劑為例的一測多評法應用研究

潘海娟，林 玲，謝學建，高 茗

0 引 言

一測多評(quantitative analysis of multi-components by single-marker，QAMS)，是通過測定一個成分(對照品容易得到者)實現多成分(對照品難以得到或不穩定者)同步定量的質量評價模式[1-2]。該方法2006年提出，至今已有近 15 年時間，經過眾多研究者的共同努力，QAMS已然成為了適合中藥特點的質量評價新模式[3-5]。同時其應用范圍已不再局限于中藥飲片、成方制劑等的質量評價，在炮制工藝優化、制劑過程考察和一致性評價等方面也有應用研究[6-7]。我院藥劑科依托醫院全軍腎臟病研究中心，多品種、多劑型的大黃制劑是科室的一大特色。保腎片、新保腎片、炎黃保腎膠囊、新腎炎膠囊是我科產值較高的4個大黃制劑，主要成分均為大黃提取物。本研究通過探討含大黃的成方制劑新保腎片中相同待測成分的定量分析，建立內參物與待測成分之間的相對校正因子(f) 并將結果應用于組成成分相似制劑(保腎片、炎黃保腎膠囊、新腎炎膠囊)的質量評價，對于拓展 QAMS 在科研和生產實踐中減少重復勞動等的應用具有重要意義。

1 儀器與材料

1.1 儀器Agilent1100高效液相色譜儀，DAD二極管陣列檢測器；電子分析天平(FA1204B，上海精密科學有限公司)；美國Waters e2695高效液相色譜系統，包括在線脫氣機，自動進樣器Prominence SIL-20A，二極管陣列檢測器waters2998和柱溫箱CTO-20A，Empower色譜工作站；萬分之一電子天平(FA1204B，上海精密科學儀器有限公司)；百萬分之一電子天平;超聲波清洗機(AS20500A，Auto Science)。Kromasil 100-5 C18色譜柱：(4.6×250 mm；5 μm)；Agilent TC-18；Accurasil C18；Diamonsil C18；Luna 5μ ODS-2 C18。

1.2 材料蘆薈大黃素(批號110795-201007)、大黃素甲醚(批號110758-201013)、大黃酚(批號110796-201319)、大黃素(批號110795-201007)、大黃酸(批號110757-200206)，以上對照品均購自中國藥品生物制品檢定所，供含量測定用。上述對照品經面積歸一化法測定，純度均〉98%。甲醇(江蘇漢邦科技有限公司)、乙腈(美國Tedia試劑公司)為色譜醇，水為超純水，95 %醫用乙醇、磷酸等均為國產分析純。新保腎片樣品批號分別為YP1-0225、YP2-0311、YP3-0326、YP4-0523、YP5-0529、YP6-0606、YP7-0611、YP8-0626、YP9-0724、YP10-0811；保腎片YP1-0302、YP2-0320、YP3-0409、YP4-0427、YP5-0521、YP6-0826、YP7-0920、YP8-1015、YP9-1122、YP10-0126；炎黃保腎膠囊YP1-0408、YP2-0505、YP3-0714、YP4-0906、YP5-1012、YP6-1117、YP7-1215；均由東部戰區總醫院藥劑科提供。

2 結 果

2.1 色譜條件Kromasil 100-5 C18色譜柱，流動相為甲醇(A)-0.1 %磷酸水溶液(B)，等度洗脫(0～80 min，A∶B=70∶30)，體積流量1.0 mL/min，柱溫35 ℃，檢測波長254 nm，進樣量10 μL。

2.2 對照品溶液的制備精密稱取各對照品，加甲醇溶解制成蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚對照品濃度分別為24.46、33.80、33.60、65.64和106.28 μg/mL的混合對照品溶液1#備用。再分別精密吸取上述混合對照品溶液9.0、8.0、7.0、6.0、5.0、4.0、3.0、2.0、1.0 mL置10 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，作為混合對照品溶液2#～10#，備用。

2.3 供試品溶液的制備取重量差異項下的新保腎片20片，除去薄膜衣，精密稱定，研細，過四號篩，精密稱取細粉約0.3 g，置平底燒瓶中，加甲醇50 mL，稱定重量，加熱回流2 h，放冷，用甲醇補足減失重量，搖勻，14 000 r/min 離心5 min，取上清液備用。 供試品與混合對照品HPLC圖譜見圖1。

1：蘆 薈大黃素；2：大黃酸；3：大黃素；4：大黃酚；5：大黃素甲醚a:供試品;b:混合對照品圖1 供試品與混合對照品色譜圖

2.4 方法學考察

2.4.1 線性關系考察分別精密吸取“2.2”項下10個濃度的混合對照品溶液10 μL，注入高效液相色譜儀，測定蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚的峰面積，得到各成分的回歸方程及線性范圍。見表1。

表1 5種大黃游離蒽醌的回歸方程和線性范圍

2.4.2 精密度實驗精密吸取同一份對照品(編號：6#)溶液10 μL，注入高效液相色譜儀，連續進樣5次，分別測定蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚的峰面積，相對標準偏差(RSD)分別為1.11%、0.95%、1.03%、1.29%和1.88%，表明儀器精密度良好。

2.4.3 重復性實驗取同一批新保腎片(樣品編號：YP2-0311)按“2.3”項下方法平行制備5份，在“2.1”項下色譜條件測定蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚的峰面積，并計算得到各成分含量RSD分別為0.91%、2.277%、2.03%、1.16%、0.94%，表明該方法的重復性良好。

2.4.4 穩定性實驗取同份新保腎片(樣品編號：YP2-0311)，室溫放置，分別在0、2、4、6、10、12 h時取樣按“2.1”項下色譜條件測定蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚的峰面積，并計算各成分峰面積，RSD分別為2.64%、2.57%、2.95%、2.78%和2.62%，表明溶液在12 h內穩定性良好。

2.4.5 加樣回收實驗取同一批新保腎片(樣品編號：YP2-0311)按“2.3”項下方法平行制備5份，在“2.1”項下色譜條件測定蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚的峰面積，并計算得到各成分含量RSD分別為0.91%、2.277%、2.03%、1.16 %、0.94%，表明該方法的重復性良好。

取己知含量的新保腎片制劑樣品(樣品編號：YP2-0311)，相當于蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚分別為0.335、0.798、0.456、1.407、1.007mg)的粉末0.3 g，精密稱定9份分成3組，各組分別按樣品含量分別加入80%、100%、120%的對照品，在“2.1”項下色譜條件測定5種成分的峰面積，并計算加樣回收率和RSD。蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚加樣回收率分別為102.39%、100.71%、102.31%、102.69%、100.89%，RSD分別為1.39%、2.06%、1.66%、0.94%、2.58%。

2.5 相對校正因子的確定校正因子的計算按線性關系考察項下的試驗方法，f=fi/fs=(Ai/Wi)/(As/Ws) ，Ai 為待測成分的峰面積，Wi 為待測成分的質量；As為內參物 s 的峰面積，Ws 為內參物 s 的質量。取“2.2”項下混合對照品溶液，在“2.1”項色譜條件下，進樣體積為 1、2、5、8、10、12、14、16、18、20 μL ，計算以大黃素為內參物時，5種大黃游離蒽醌間的f值，分別為f蘆薈大黃素/大黃素=0.75、f大黃酸/大黃素=0.87、f大黃酚/大黃素=0.89、f大黃素甲醚/大黃素=3.39。

2.6 相對校正因子的耐用性評價

2.6.1 不同色譜柱系統對f的影響采用Kromasil 100-5 C18色譜柱，分別考察了Agilent1100和Waters e2695共2種不同的高效液相色譜柱對相對校正因子的影響。結果顯示蘆薈大黃素、大黃酸、大黃酚和大黃素甲醚的相對校正因子的RSD分別為2.28%、1.03%、1.57%和4.29%。

2.6.2 不同柱溫對f的影響釆用Agilent1100高效液相色譜儀，Kromasil 100-5 C18色譜柱，分別在30 ℃、35 ℃和40 ℃對蘆薈大黃素、大黃酸、大黃酚和大黃素甲醚相對校正因子進行測定。結果顯示相對校正因子的RSD分別為1.49%、1.53%、0.23%、3.19%，表明柱溫對相對校正因子無顯著性影響。

2.6.3 不同流速對f的影響釆用Agilent1100高效液相色譜儀，Kromasil 100-5 C18色譜柱，分別在不同流速(0.9 mL/min、1.0 mL/min、1.1 mL/min)下對蘆薈大黃素、大黃酸、大黃酚和大黃素甲醚相對校正因子進行測定。結果顯示相對校正因子RSD分別為0.74%、0.88%、0.88%、3.26%，表明流速對相對校正因子無顯著性影響。

2.6.4 不同修飾劑對f的影響釆用Agilent1100高效液相色譜儀，Kromasil 100-5 C18色譜柱，分別考察流動相中不容修飾劑對5種蒽醌間相對校正因子進行測定。結果顯示相對校正因子無顯著性影響，RSD<5%。綜合不同系統、不同色譜柱、不同柱溫、不同流速度、不同修飾劑對相對校正因子的影響，最終取所有相對校正因子的平均值為f蘆薈大黃素/大黃素=0.75、f大黃酸/大黃素=0.88、f大黃酚/大黃素=0.89、f大黃素甲醚/大黃素=3.25。

2.7 待測成分的色譜峰定位待測成分色譜峰的定位通常采用相對保留值法或保留時間差法輔以待測成分的紫外吸收特征，一般即能對色譜峰進行準確定位。相對保留值即待測成分i與內參物s間的保留時間的比值，計算公式：ri/s=tRi/tRs；保留時間差即待測成分i與內參物s間保留時間的差值，計算公式：△tRi/s=tRi-tRs；實驗中分別考察了復方蒽醌類成分間的相對保留值和保留時間差在不同品牌儀器和不同品牌色譜柱中的重現性。結果表明，保留時間差的波動較為明顯，相對保留值的波動較小，因此采用相對保留值法進行新保腎片復方中蒽醌類待測成分色譜峰的定位較為可行。最終確定5種復方制劑蒽醌間的相對保留值分別為r蘆薈大黃素/大黃素=0.36、r大黃酸/大黃素=0.52、r大黃酚/大黃素=1.36、r大黃素甲醚/大黃素=2.13。

2.8 QAMS和外標測定結果比較首先采用外標法(ESM)對10批新保腎片(批號分別為YP1-0225、YP2-0311、YP3-0326、YP4-0523、YP5-0529、YP6-0606、YP7-0611、YP8-0626、YP9-0724、YP10-0811)樣品中的5種蒽醌類成分進行多成分同步測定，再用建立的QAMS法對待測成分進行定位并計算含量，最后將2種方法得到的結果以相對誤差進行評價，以驗證QAMS技術用于新保腎片中蒽醌類多成分質量評價的準確性。結果表明，2種方法所得結果無顯著性差異，相對誤差<5%，表明建立的新保腎片QAMS質量評價模式具有較好的準確性與可行性。見表2。

表2 QAMS和ESM測得新保腎片中5種蒽醌類成分的含量結果(n=2，mg/g)

2.9 QAMS數據在類似制劑中的應用將本實驗結果f蘆薈大黃素/大黃素=0.75、f大黃酸/大黃素=0.88、f大黃酚/大黃素=0.89、f大黃素甲醚/大黃素=3.25應用到我科保腎片、炎黃保腎膠囊、新腎炎膠囊的含量測定中，比較在不同制劑、不同劑型中ESM和QAMS的測定結果，結果表明，一測多評質量評價體系應用于我院的保腎片、炎黃保腎膠囊、新腎炎膠囊時方法所得結果無顯著性差異，相對誤差<5 %，表明在主要組成均為大黃提取物的制劑中，即便是不同的劑型，所建立的QAMS質量評價模式也可以用于不同制劑的質量控制。見表3-表5。

表3 QAMS和ESM測得保腎片中5種蒽醌類成分的定位結果 (n=2，mg/g)

表4 QAMS和ESM測得炎黃保腎膠囊中5種蒽醌類成分的定位結果(n=2，mg/g)

表5 QAMS和ESM測得炎黃保腎膠囊中5種蒽醌類成分的定位結果(n=2，mg/g)

3 討 論

QAMS經過多年的發展與實踐，在中藥材，飲片和提取物質量評價中的應用已被行業普遍接受，但應用于中成藥仍處于探索和研究階段。建立了QAMS檢測方法在實際生產檢測中操作較EMS方法更加簡便、快速[8-10]。本研究選擇了主要組成相似，但劑型不同的四個制劑，以新保腎片為主要研究對象，建立的QAMS評價模式應用于保腎片、炎黃保腎膠囊、新腎炎膠囊，結果表明ESM與QAMS數據無顯著性差異。實驗在相同色譜條件下待測成分分離度良好并且無干擾情況下，經過系統驗證的藥材中目標成分的fs 可以直接應用于制劑對應成分含量計算，無需重新進行fs 的建立和耐用性考察，可以節省大量的研究時間和分析成本[11-12]。研究為大黃制劑質量標準的完善和提高提供數據支撐的同時，并為拓展一測多評法在中成藥質量評價和控制中的應用，為組成類似的系列制劑質量標準的建立提供了新的研究思路和方法參考[13-15]。