人臍帶組織間充質干細胞在膝骨關節炎軟骨修復中的應用與進展

龐永華綜述，陳偉南審校

0 引 言

骨性關節炎(Osteoarthritis, OA)是一種常見的慢性關節退行性疾病，膝關節發病率最高，主要影響65歲以上的老年人，據聯合國估計，2050年全世界將有1.3億人受OA的影響，其中4000萬人將因該病嚴重致殘[1-2]。關節軟骨的表層分解、磨損以及骨摩擦，最終導致關節軟骨的退化，進而引起關節疼痛、腫脹和僵硬，甚至致殘，給患者帶來了巨大的痛苦[3]。目前，早期膝關節OA的治療主要是保守治療，包括減肥、理療、鍛煉、口服非甾體抗炎藥物，效果不佳時也可采取膝關節腔注射療法，如關節腔內注射皮質類固醇、透明質酸衍生物和其他生物活性物質等；當上述治療均無效時，最后選擇手術干預，如截骨、人工關節置換術等[4-6]。

從生物學的角度來看，OA軟骨缺損的治療在臨床上極具挑戰性，因為軟骨細胞天然再生潛力有限，尤其是隨著年齡的增長[7]。因此，針對軟骨進行再生醫學研究成為OA治療的新趨勢。目前有許多用于軟骨修復的治療方法，如微骨折、自體骨軟骨移植、自體軟骨細胞植入(autologous chondrocyte implantation，ACI)等，然而，這些技術在治療上都有著各種限制，如缺乏再生透明軟骨的潛力，與自身軟骨組織的整合不規則，軟骨細胞來源有限，且可能引起正常軟骨病變等，都不能夠令患者達到滿意的效果[4,8]。

近年來，以間充質干細胞為基礎的治療因其良好的自我更新和再生能力，為再生和重建醫學提供了巨大的前景[9]。間充質干細胞主要包括骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BM-MSCs)、脂肪間充質干細胞、滑膜間充質干細胞和人臍帶間充質干細胞等[9]。最近在人臍帶組織中發現了人臍帶Wharton膠間充質干細胞(Wharton’s jelly mesenchymal stem cells，WJ-MSCs，以下簡稱“WJ-MSCs”)，相關研究表明其在臨床再生工程及早期干預膝關節OA的治療中具有廣闊的應用前景，故本文對WJ-MSCs的特點及在膝骨關節炎軟骨修復中的相關應用作一綜述，以期未來臨床上為膝骨關節炎軟骨修復提供一種新的臨床路徑。

1 WJ-MSCs的生物學優勢

1.1 來源及作用Thomas Wharton于1656年首次觀察到Wharton’s jelly(Wharton膠)，Wharton膠是臍帶的原始黏液結締組織，位于羊膜上皮和臍帶血管之間，這種膠狀物質由蛋白多糖和各種膠原亞型組成，其主要作用是隔離、保護臍帶，防止臍帶血管的壓縮、扭轉和彎曲，從而提供氧氣、葡萄糖和氨基酸的雙向流動平臺，同時也消耗胎兒和胎盤的二氧化碳和其他廢物[11]。1991年，McElreavey等[12]首次從臍帶Wharton膠部分中分離出MSCs。

1.2 形態特征MSCs的典型特征是塑性粘附。Ranjbaran等[13]在倒置相差顯微鏡下可見紡錘形的MSCs和成纖維細胞，WJ-MSCs呈現為均勻的單層貼壁梭形細胞；并發現在原代傳代中，細胞以梭狀成纖維細胞的形式迅速增殖，當傳代培養至第七代之后細胞特征發生了明顯改變，故WJ-MSCs培養至第七代之前均較適合于臨床應用。

1.3 細胞表面標記Karahuseinoglu等[14]研究表明，WJ-MSCs表面不僅表達間充質干細胞的表面特異性標記，如CD44、CD13、CD29、CD105；還表達CD10、CD73、CD49、CD166、CD90和CD146；同時不表達CD14和CD34,此外還表達與移植免疫排斥反應相關的表面標記，如CD86、CD80和CD40。Ramanathan等[15]研究同樣發現，WJ-MSCs的表面標志物CD90、CD73、CD105陽性,造血標志物CD14、CD34和CD45陰性。且WJ-MSCs不表達內皮細胞抗原CD31，與BM-MSCs表型一致，表明WJ-MSCs可能具有與BM-MSCs相似的功能[16]。在WJ-MSCs中SH2、CD106和HLA-1的表達均低于BM-MSCs，這表明WJ-MSCs可能是一個更原始的間充質干細胞群體，具有更強的定向分化能力[17]。

1.4 免疫原性干細胞治療的一個重要要求是低免疫原性。WJ-MSCs的治療效用與其免疫調節密切相關，WJ-MSCs具有免疫抑制和免疫回避的能力，是同種異體移植細胞治療的最佳選擇之一。WJ-MSCs不僅表面顯示出人I類白細胞抗原(human leukocyte antigen，HLA)的較低表達和HLA-DR的缺失[18]；且可誘導調節性T細胞的擴增，有助于抑制機體對抗原的免疫反應[19]；還有研究發現WJ-MSCs不引起異體T細胞產生體外免疫應答，表明WJ-MSCs具有特異性低免疫原性，在異體移植中可耐受[19]。WJ-MSCs的免疫調節作用涉及免疫系統中的細胞介導成分和體液成分；然而，WJ-MSCs對B細胞的影響還未得到很好的研究，需要進一步驗證[21]。

1.5 分泌特性WJ-MSCs還具有旁分泌功能，可分泌多種生物活性分子，作為細胞間重要的信號傳遞物質，參與WJ-MSCs介導的損傷修復和免疫調節。如MSCs分泌的生長因子、趨化因子和細胞因子，可通過細胞膜、囊泡和粘附分子遷移到受損組織發揮其組織修復功能[22]。WJ-MSCs分泌的可溶性分子，如肝細胞生長因子(hepatocyte growth factor，HGF)，前列腺素E2，TGF-β1和吲哚胺23-雙加氧酶(indoleamine 2,3-dioxygenase，IDO)可能介導MSCs對T細胞的免疫調節作用[23]。越來越多的證據表明，WJ-MSCs療效的機制主要取決于細胞分泌物，而不是早期的細胞替換和分化[22]。

2 WJ-MSCs在應用中的優勢

2.1 可行性大部分干細胞的收集(如BM-MSCs)都需要侵入性操作，且大規模提取比較困難。但WJ-MSCs的收集則是一種無創操作，較易進行；而且臍帶屬于胚胎外組織，目前大多數醫院將臍帶作為醫療廢物處理，提取WJ-MSCs不涉及倫理問題。因此，WJ-MSCs來源豐富，易于收集，對供體無不良影響[24]。

2.2 保存WJ-MSCs具有良好的凍融性能，可長期冷凍在液氮杜瓦瓶中，需要時解凍即可。該特性便于WJ-MSCs的基本實驗工作，為今后建立“臨床資源庫”提供了良好的理論依據[25]。

2.3 低免疫原性WJ-MSCs表面共刺激分子CD86和CD40數量少，缺乏HLA-DR和CD80，表明其具有較低的免疫原性表型；另外，WJ-MSCs還表達一些具有免疫調節功能的分子，如IDO-1、IL-10、LIF、PD-L1、COX-2、TGF-β1、TSG-6、CD200、HGF、非經典HLA1類分子HLA-E和HLA-G以及HO-1，這種抑制分子的表達進一步增強了WJ-MSCs的低免疫原性特征[26]。

2.4 增殖與分化潛能BM-MSCs是組織工程中最常用的細胞來源，與BM-MSCs相比，WJ-MSCs具有更強的增殖能力，特別是在培養7天后，后者出現累積群體倍增的顯著差異；且BM-MSCs在達到100%表面匯合后便停止增殖，WJ-MSCs則未出現接觸抑制現象[27]。Reppel等[28]在不添加生長因子的情況下，在三維支架上培養WJ-MSCs，并在轉錄和蛋白質水平上評價其軟骨分化能力，并將其結果與標準BM-MSCs進行了比較；發現經過28天的支架培養后，WJ-MSCs軟骨特異性標記在轉錄水平上的表達明顯上調，表明WJ-MSCs在軟骨分化能力方面優于骨髓等其他來源的干細胞。

3 目前世界范圍內使用WJMSCs治療骨關節炎的進展

近年來，關于如何運用WJ-MSCs進行關節軟骨修復的研究在世界范圍內逐漸得以開展，主要分為以下幾個方面。

3.1 體外基礎試驗Aleksander-Konert等[29]從臍帶Wharton膠中分離出WJ-MSCs，用兩種常見的透明質酸水凝膠(HyStem和HyStem-C)將培養的WJ-MSCs和軟骨細胞以每100微升15000和30000個細胞的密度進行球形封裝；與在二維培養物中相比，WJ-MSCs和軟骨細胞在該透明質酸水凝膠中的平均活力約為前者的67%，且WJ-MSCs和軟骨細胞的存活率均較高; Alcian藍和蕃紅O染色顯示WJ-MSCs在水凝膠產生了大量蛋白聚糖；實時PCR顯示在該水凝膠中Ⅱ型和Aggrecan膠原表達增加；提示WJ-MSCs具有較高的向軟骨細胞分化的能力。該研究表明WJ-MSCs在透明質酸水凝膠中具有一定程度的軟骨形成潛力，為軟骨損傷修復組織工程中支架的選擇提供了一定的指導作用。

3.2 動物實驗解光越等[30]利用臍帶WJ-MSCs復合藻酸鈉水凝膠成功修復兔膝關節骨軟骨缺損，病理學染色提示修復組織以透明軟骨為主，且與周圍正常組織整合良好，未見嚴重不良反應事件，提示人臍帶WJ-MSCs在利用組織工程技術軟骨修復中具有巨大前景和潛力。Liu等[31]研究探討了利用人臍帶WJ-MSCs對兔軟骨全層缺損進行組織修復的試驗。在16個月的研究過程中，觀察到hWJ-JMSCs有序重塑為軟骨組織，其重塑特征包括：新生軟骨層主要為透明軟骨，表面具有良好的規律性，與鄰近宿主軟骨完全整合且軟骨下骨再生；并且在兔軟骨缺損處植入人臍帶WJ-MSCs，未發現免疫排斥反應；在評估再生軟骨的大體外觀和組織學分級評分后，發現人臍帶WJMSCs的修復結果優于軟骨誘導的人臍帶WJ-MSCs。該研究提示與利用轉化生長因子誘導的分化型WJ-MSCs進行體內組織工程治療相比，使用未分化人臍帶WJMSCs作為種子細胞可能是一種更好的選擇。

Wu等[32]探討了利用人臍帶WJ-MSCs和透明質酸水凝膠復合材料對豬OA模型軟骨修復的研究。運用相同的手術操作對同一只豬的雙膝關節制造相同的全層軟骨缺損模型，實驗組將1.5 mL的WJ-MSCs(5×106細胞)和透明質酸水凝膠(濃度4%)復合材料移植將到右膝軟骨缺損處，左膝作為空白對照。移植12周后，與對照組相比，實驗組透明軟骨再生改善明顯，且膝關節組織學評分明顯高于對照組。該研究提示使用人臍帶WJ-MSCs和透明質酸水凝膠的復合材料進行軟骨再生可能是未來臨床早期治療膝關節OA軟骨缺損的有效方法，但相關研究結果仍需進一步完善。

3.3 臨床試驗Park等[33]對應用同種異體人臍帶血MSCs(hUCB-MSCs)與透明質酸水凝膠復合材料治療的骨關節炎患者進行了長達7年的隨訪。該研究將Kellgren-Lawrence 3級和國際軟骨修復協會(ICRS)4級軟骨缺損的骨關節炎患者納入臨床試驗，hUCB-MSCs和透明質酸水凝膠組成的復合材料通過關節鏡微創手術植入病變部位。有7名參加者參加了為期7年的長期隨訪，在術后12周的關節鏡評估中觀察到成熟的修復組織；術后24周時，VAS和IKDC評分均有所改善，且改善的臨床結果在7年的隨訪中是穩定的；術后1年再生軟骨組織學表現為透明軟骨，術后3年的MRI顯示再生軟骨持續存在。該隨訪僅觀察到5例輕中度治療——緊急不良事件，7年隨訪內無成骨或腫瘤發生病例。該隨訪提示這種新型的基于臍帶間充質干細胞的藥用產品，在骨關節炎患者的軟骨再生的治療上似乎是安全有效的，但是隨訪時間不長且病例數不夠多，后續需要更長久的隨訪和更多病例的研究。且人臍帶血與Wharton膠屬于臍帶內的不同區域，該研究對后者的研究有一定的提示意義。

楊孝兵等[34]發現通過移植人臍帶WJ-MSCs(1×107/mL,約2.5 mL)治療嚴重OA較透明質酸鈉能夠明顯、較持久地緩解關節疼痛、改善關節功能，且4次注射療效優于2次注射，但該研究似乎僅證明了注射人臍帶WJ-MSCs可改善患者的臨床癥狀，生物學角度對于軟骨缺損修復的療效缺乏佐證，可能需要更進一步的研究。Matas等[35]同樣也評價了利用人臍帶WJ-MSCs單次或多次關節腔內注射治療膝骨關節炎的安全性和有效性。試驗組患者膝關節腔內每6個月注射劑量為2×107，3 mL的WJ-MSCs，對照組僅注射HA，在術后12個月內的隨訪中，發現注射WJ-MSCs的患者疼痛和功能得到明顯改善，臨床評分明顯比對照組高；且未見死亡、腫瘤或感染等嚴重不良反應；影像學結果無統計學差異。雖然該研究提示多次注射WJ-MSCs治療骨關節炎短期內能緩解疼痛且具有良好的安全性，但是研究周期短，缺乏遠期療效的隨訪，安全性有待進一步論證。

4 結 語

近年來，隨著干細胞療法在各種疾病模型中研究的逐漸深入，關于膝關節OA治療的相關研究也逐漸得以開展，人臍帶WJ-MSCs具有來源廣泛、獲取簡單、不涉及倫理問題、低免疫原性、強增殖能力、多向分化能力、免疫調節能力、無致瘤性等優勢，在未來臨床應用人臍帶WJ-MSCs治療OA方面，顯示出良好的應用前景。尤其是組織工程學中利用人臍帶WJ-MSCs治療膝關節OA軟骨缺損，根據目前國內外相關研究報道，使用WJ-MSCs治療膝關節OA短期內是安全且有效的。然而有些地方仍需進一步研究，如：①誘導WJ-MSCs定向分化的信號通路及相關機制不夠了解，如何提高其定向軟骨分化能力是目前研究的熱點與難點。根據現有文獻報道，提高其軟骨定向分化的常見方法包括：與軟骨細胞共培養可提高WJ-MSCs的軟骨定向分化能力，其次分化培養基中添加生長因子，如胰島素樣生長因子、成纖維細胞生長因子和TGF- β也可增強其軟骨分化，此外還可通過在3D支架組合MSC和生物材料刺激或通過操縱氧張力來提高其軟骨定向分化；另外最近證據表明，microRNA(miRNA)在軟骨分化中起著重要作用，因此，在軟骨分化過程中研究miRNA可能有助于了解MSCs中軟骨分化的調控機制，關于軟骨分化中的調控機制仍需進一步研究完善；②關節軟骨損傷程度與干細胞治療的相關性沒有明確的標準；③臨床試驗的設計、注射和移植選擇時機的缺乏一定的標準；④臨床試驗缺乏遠期隨訪結果；⑤動物試驗模型并不能完全模擬OA的微環境，更優化的模型有待進一步完善。因此，在之后的研究中應著力解決這些不足之處，為廣泛應用WJ-MSCs治療膝關節OA軟骨缺損提供進一步的理論依據，以期未來能夠成功的修復膝關節OA軟骨缺損并逆轉其進程。