視網膜色素變性和視錐-視桿細胞營養不良患者基因突變頻譜分析

任英華，盛迅倫，賈 沁，容維寧，張 爽

?KEYWORDS:autosomal recessive inheritance; retinitis pigmentosa; cone-rod dystrophy; gene detection; mutation analysis

0引言

遺傳性視網膜變性疾病(hereditary retinal dystrophies, HRD)是臨床上最常見的致盲性遺傳性視網膜變性疾病[1]，主要病因為遺傳性基因突變，具有高度的臨床和遺傳異質性。其中常染色體隱形遺傳視網膜色素變性(autosomal recessive retinitis pigmentosa, ARRP)和常染色體隱形遺傳視錐-視桿細胞營養不良(cone-rod dystrophy, CORD)兩種疾病的表型之間具有一定程度的相似性和交叉性，致病基因又有重疊性，從遺傳學及臨床表型探索疾病的特點有利于發現疾病規律，進一步尋找共同治療靶點。視網膜色素變性(retinitis pigmentosa, RP)是由于光感受器(視桿細胞和視錐細胞)或視網膜色素上皮的結構或功能異常相關的一類遺傳性進行性致盲眼病，其發病機制尚未完全明確，在由單一基因所致盲的遺傳性眼病中RP發病率占首位。世界范圍內的發病率為1/4000[2]，影響全世界約250萬人[3]。CORD以視錐細胞受損為主，伴不同程度的視桿細胞損傷。兩者均為高度臨床異質性和遺傳異質性眼病，許多基因缺陷均可導致上述兩種疾病的發生，目前不能通過基因檢測結果直接進行準確診斷，限制了本病基因診斷在臨床的廣泛應用。本研究應用目標序列捕獲結合二代測序技術對ARRP和CORD患者進行基因突變頻譜檢測分析，同時結合臨床表型分析，初步探討ARRP和CORD的診斷和鑒別診斷。

1對象和方法

1.1對象選擇2016-09/2020-02在寧夏眼科醫院就診的35例ARRP患者和18例CORD患者納入研究，采集先證者及家系成員病史資料，所有患者及其家庭成員均接受詳細的眼部檢查，包括裂隙燈顯微鏡、間接檢眼鏡、裸眼視力、最佳矯正視力、視野、彩色眼底照相、頻域光相干斷層掃描(optical coherence tomography, OCT)、熒光素眼底血管造影及視網膜電圖(electroretinogram, ERG)等檢查。ARRP納入標準：(1)符合ARRP的診斷標準:1)首發夜盲史；2)視力逐漸下降；3)眼底表現為視盤色蠟黃或變淡，視網膜血管變細，周邊視網膜可見骨細胞樣色素沉著，晚期視野呈向心性縮窄；4)暗適應檢查早期視桿細胞功能降低，視錐細胞功能正常，隨著病情的進展，視錐視桿細胞功能均下降甚至喪失；(2)通過系譜分析確定為RP患者。ARRP排除標準：通過全身檢查排除綜合征性RP患者、非典型RP患者。常染色體隱性遺傳CORD納入標準：(1)符合CORD的診斷標準：1)首發視力逐漸下降；2)視野出現中心暗點；3)全視野ERG出現視錐視桿細胞功能均下降甚至喪失，并且視錐細胞功能和視桿細胞功能相同或受損更嚴重；4)多數患者眼底檢查和黃斑OCT檢查顯示黃斑萎縮；(2)通過系譜分析確定為CORD患者。常染色體隱性遺傳CORD排除標準：通過全身檢查及基因檢測排除誤診為CORD患者。本研究遵循赫爾辛基宣言，并經寧夏回族自治區人民醫院寧夏眼科醫院倫理委員會審核通過批文號，所有研究對象和未成年患者監護人均簽署知情同意書。

1.2方法

1.2.1DNA提取及測序分析從受檢者外周血中提取DNA。應用的目標序列捕獲芯片包括232個由RetNet網站(https://sph.uth.edu/RETNET)所公布的HRD已知致病基因，針對已知的致病基因及突變位點定制特異性的寡核酸苷酸探針，通過Agilent SureSelect外顯子靶向序列富集系統對目標基因組區域進行液相捕獲，高通量測序儀(Illumina HiSeqTM2000)進行測序。將高通量二代測序結果應用Burrows-Wheeler Aligner軟件同University of California Santa Cruz(UCSC)人類基因組對照序列hg19完成比對，并運用Genome Analysis Tool Kit工具對獲得的測序結果進行校準及完善。將檢測獲得的DNA序列變異信息與單核苷酸多態性數據庫進行比對過濾，應用ANNOVAR對剩余的突變基因進行蛋白質的改變預測，剔除同義突變，利用專業版人類基因突變數據庫進行基因位點檢索獲得候選致病突變位點。對可疑致病變異進行Sanger驗證及家系共分離分析。

1.2.2數據分析依據美國醫學遺傳學與基因組學學會(American college of medical genetics and genomics, ACMG)，2015年發布的《序列變異解讀標準和指南》對新發變異進行基因變異致病性評估。已報道變異分類標準參考文獻方法[4]，采用GERP++軟件和UCSC(http://genome.ucsc.edu/)在線工具對突變位點的氨基酸進行保守性分析。在1000Genome(http://browser.1000genomes.org/index.html)、EVS(http://evs.gs.washington.edu/EVS/)和ExAC(http://exac.broadinstitute.org/)數據庫中查看變異在正常人群中的等位基因頻率，最小等位基因頻率小于0.005作為排除良性變異的標準。選用Polyphen-2(http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2)、SIFT(http://sift.jcvi.org)、PROVEAN(http://provean.jcvi.org/index.php)和MutationTaster(http://www.Mutationtaster.org)進行致病性預測。用Human Splicing Finder和MaxEntScan(http://www.umd.be/HSF/)預測變異對pre-mRNA正確剪切的影響。使用HOPE(https://www3.cmbi.umcn.nl/hope)分析變異對于編碼蛋白結構的影響。

2結果

有些遺傳性眼病家系中除先證者外，家庭成員中暫找不到其他患者，無法確定其遺傳方式，既往稱為散發型。但是隨著近年來二代測序技術的廣泛應用，許多對散發遺傳性眼病的研究表明這些病例大部分屬于常染色體隱性遺傳。本研究的35例ARRP患者中，首發癥狀為夜視力下降者26例，不同程度進行性視力下降者為5例，健康查體發現為4例，首發癥狀年齡為6～49歲，最佳矯正視力范圍為0.1～2.0。本研究的18例CORD患者中，首發癥狀為進行性視力下降，首發癥狀年齡為12～36歲，最佳矯正視力范圍為指數/30cm～0.3。

本研究中對35例ARRP患者和18例CORD患者進行基因檢測分析，其中表1提示：在35例ARRP患者中，檢測到突變基因共有16個，分別是ABCA4、C2orf71、C8orf37、CLRN1、EYS、CLN3、CRB1、CNGA1、KIAA1549、MERTK、NRL、PROM1、RDH12、RHO、RP1和TULP1，其中以RP1基因突變率最高，占14%(5/35)，其次為以ABCA4、CRB1和EYS基因，均占11%(4/35)；表2提示：18例CORD患者中，共檢測到突變基因10個，分別是ABCA4、ALMS1、CLN3、CRB1、NRL、PROM1、RPE65、USH2A、GUCY2D、CDH23，其中以ABCA4基因突變率最高，占28%(5/18)，其次為以ALMS1、PROM1、RPE65、USH2A基因，均占11%(2/18)；在ARRP和CORD患者中，共同致病基因有ABCA4、CLN3、CRB1、PROM1、NRL共5個，占42%(22/53)。

表1 ARRP患者中突變基因位點

表2 常染色體隱性遺傳CORD患者中突變基因位點

3討論

在HRD的研究中，致病基因臨床表型存在很大的異質性。研究HRD表型異質性有利于豐富疾病表型譜特征，促進HRD的精準診斷和個體化治療。本研究應用目標序列捕獲結合第二代測序技術對患者進行突變基因篩查，篩查技術快速而準確。在ARRP和CORD兩種疾病中，ARRP共篩查出16個致病基因，CORD共篩出10個致病基因，覆蓋范圍為常見致病基因，表現為高度的遺傳異質性和臨床異質性，其中有5個共同致病基因，分別為ABCA4、PROM1、CLN3、CRB1、NRL。ABCA4的檢出頻率最高，其次為PROM1。根據RetNet網站公布的數據(RetNet：https://sph.uth.edu/Retnet/sum-dis.htm)顯示，ABCA4、C8orf37、CERKL、PROM1共4個基因既可以導致ARRP又可導致CORD。由此可見，以上ARRP和CORD兩種疾病的致病基因具有重疊性，本研究結果中檢測出5個共同致病基因也證實了這一結果。由于ARRP和CORD兩種疾病無論在表型上還是在疾病進展嚴重程度上均表現一定程度的相似性和交叉性，在不同年齡階段和疾病發展的不同時期具有明顯的臨床異質性，在致病基因上也存在一定重疊，兩種疾病表型主要區別在于首發臨床癥狀，ARRP首發癥狀為夜盲，該癥狀可持續多年后出現視力下降，此時ERG檢查表現視錐視桿細胞均重度下降。本研究中患者首診原因主要為夜視力下降，最佳矯正視力范圍0.1～2.0，視盤顏色明顯變淡或蠟黃，視網膜血管變細，后極部及周邊散在骨細胞樣色素顆粒沉著。而CORD首發癥狀主要為視力下降，主要為視錐細胞功能障礙伴較晚的視桿細胞受累，黃斑區視網膜外層光感受器受損，隨年齡增長范圍擴大，可累及周邊部甚至全視網膜，ERG檢查視錐細胞反應可呈熄滅型或明顯下降。

ABCA4基因突變能夠引起Stargardt病(STGD)、COD/CORD、ARRP或部分類型的年齡相關性黃斑變性等臨床表型，且患者的發病年齡、發病特點也各不相同，ABCA4基因突變人群發生率是4.5%～10%[5]。ABCA4基因定位于1p22.1，主要編碼ABCA4蛋白，ABCA4蛋白是感光細胞中重要的功能性蛋白。功能正常的ABCA4蛋白能夠將視循環視黃醛代謝的中間產物N-視黃基磷脂酰乙醇胺轉運，幫助其自發分解為全反式視黃醛，進入視循環。當ABCA4蛋白功能異常時，N-視黃基磷脂酰乙醇胺聚集，并隨感光細胞脫落至RPE中，經進一步反應生成N-亞視黃基-N-視黃基乙醇胺(A2E)，A2E是脂褐質的主要基團，具有細胞毒性，會導致RPE細胞凋亡[6]，進而破壞視網膜色素上皮的結構和功能，導致疾病發生和發展。一般常染色體隱性遺傳發病早，病情進展快。視功能損害較為嚴重。王曉光等[7]研究表明，ABCA4基因突變出現在CORD患者及其同胞妹妹基因檢測中，二者雖致病基因一致，但眼底表現存在差異，因此，僅通過基因檢測難以做出準確診斷，需與臨床表型相結合分析才能確定診斷。本研究中，ABCA4重疊出現的頻次最高，且是由不同突變位點導致不同疾病的發生，臨床表現也出現多樣化。

PROM1基因定位于4p15.32，在視網膜中的確切生理作用尚不清楚，PROM1相關的臨床表型主要包括STGD，CORD等。PROM1蛋白定位于光感受器外段[8-9]。有研究發現PROM1-/-小鼠表現出Rdh12和ABCA4的顯著下調，并推測PROM1缺乏的下游事件是A2E/脂褐素的累積，并加重ABCA4基因突變的效應[10]。研究發現PROM1相關的形態表型均與CORD相關[11]。本研究中ARRP家系的PROM1基因突變位點為c.27_28del(p.L9fs)c.2309C>A(p.P770H)和c.2788-52C>A(NA)，成員尚未見錐桿細胞營養不良，可能與疾病發展階段相關，需要長期隨訪。CORD家系的PROM1基因突變位點為c.544dupC(p.Q182fs)和c.2373+5G>T(NA)。

CLN3基因首先被報道為神經元蠟樣脂褐質沉積癥的致病基因，基因定位于染色體16p12.1～p11.2[12]，編碼的蛋白是一個完整的膜蛋白，眼內CLN3主要定位于視網膜感光細胞的內段、視網膜內部細胞和Müller細胞中，與高爾基體和突觸蛋白的運輸相關[13]，為凋亡抑制基因。其突變常與神經退行性疾病相關，眼病患者表現為CORD，其視桿細胞功能降低明顯，而視錐細胞功能多變[13]。最早關于CLN3的研究是Batten病，這是一種感光細胞及神經細胞過度凋亡引起的常染色體隱性遺傳的神經退行性疾病，病理表現為腦神經元細胞的凋亡及內源性神經酰胺水平升高[14]，患者的CLN3有近1kb的基因缺失，臨床表現為精神、運動系統退行性疾病迅速進展，癲癇發作、發育不良、小頭畸形，共濟失調和感光細胞退化而導致的視力喪失。2014年，Wang等[15]報導CLN3可引起ARRP和CORD,但未見全身癥狀。本研究中ARRP患者CLN3基因突變位點為c.416G>A(p.G154D)，而CORD患者基因突變位點為c.1012C>T(p.R338C)c.107_124del(p.36_42del)，未發現神經系統異常，伴隨疾病的發展，是否會出現神經系統異常需要長期隨訪觀察。

CRB1基因定位于1q31.3，要在光感受器內段以及大腦中表達，主要參與光感受器形態形成，突變可能抑制視網膜的發育，導致光感受器信號傳導的丟失[16]。CRB1突變的臨床表型主要有RP和Leber先天性黑朦[17]，本研究在CORD中也發現2例CRB1基因突變，突變位點分別為c.T514C(p.C172R)和c.2378G>A(p.R793Q)。

NRL基因定位于14q11.2，編碼合成堿性亮氨酸拉鏈蛋白，屬于DNA結合蛋白的亮氨酸拉鏈家族。對視桿細胞的發育和分化具有重要作用。表達于成熟視網膜中。在模仿人類視網膜的發育研究中發現NRL敲除會導致視桿細胞的完全缺失[18]，并且NRL也是RP基因治療的靶點之一[19]。

綜上所述，目標區域測序的基因診斷方法是檢測HRD的強大工具,結合臨床表型才能更準確的做出臨床診斷。在ARRP和CORD兩種疾病中，存在表型異質性和致病基因的重疊，同一基因不同位點突變可以導致不同疾病或同一疾病但不同臨床表型。因此，對ARRP和CORD的診斷需要依據基因檢測結果和更多更深入的臨床研究。遺傳性眼病表型復雜，明確基因型和臨床表型關系有利于輔助基因治療的研究。