105例皮肌炎/多發性肌炎/腫瘤相關性肌炎臨床特征和外周血淋巴細胞亞群特點

張盼娣，李 芳

特發性炎癥性肌病(idiopathic inflammatory myopathy，IIMs)是一組以骨骼肌和皮膚慢性炎癥為特征的易質性、自身免疫性疾病，伴有近端對稱性肌無力、血清肌酶升高以及特定的皮膚病變和肌肉外表現[1-2]，包括皮肌炎(dermatomyositis，DM)、多發性肌炎(polymyositis，PM)、包涵體肌炎(inclusion body myositis，IBM)、非特異性肌炎(nonspecific myositis，NSM)和免疫介導的壞死性肌病(immune-mediated necrotizing myopathy，IMNM)等。其中，伴有腫瘤的肌炎常被稱為腫瘤相關性肌炎(cancer associated myositis，CAM)，通常定義為在診斷肌炎前后3年內發生腫瘤的病人[3]，以DM、PM多發。目前IIMs的致病機制尚未明確，多數認為是遺傳易感個體在感染與非感染因素誘導下由免疫介導的疾病。DM通常被認為是CD4+T細胞驅動的疾病，PM可能為CD8+T細胞介導的自身免疫過程[4]，而CAM大多數被認為具有副腫瘤性質[5]。研究發現IIMs病人的肌肉組織有免疫細胞浸潤和促炎細胞因子的表達，表明免疫失衡在IIMs的發病中起重要作用。本研究收集105例DM、PM、CAM病人的一般信息、臨床及實驗室等資料，分析3組病人的臨床特征與外周血淋巴細胞亞群等實驗室相關指標，明確疾病發生可能參與的免疫細胞，探討潛在的致病機制，以利于臨床早期診治。

1 資料與方法

1.1 研究對象 選取2017年12月—2019年6月就診于山西醫科大學第二醫院風濕免疫科的住院病人105例為病例組，均符合1975年Bohan/Peter提出的診斷標準。其中，DM病人56例，男21例，女35例；年齡26～78(49.71±13.12)歲；病程6.00(2.00，24.00)個月；PM病人24例，男11例，女13例；年齡31～76(48.17±12.21)歲；病程30.00(2.00，93.00)個月；CAM病人25例，男9例，女16例；年齡28～76(59.44±8.49)歲；病程7.50(2.00，51.00)個月。所有病人臨床及實驗室資料完整。排除標準：合并各種急慢性感染、甲狀腺功能減退或伴其他傳染性疾病者；重疊其他風濕免疫系統疾病者。同期選取我院體檢中心的健康體檢者103名為健康對照組，男62名，女41名，年齡20～78(45.81±13.41)歲，無風濕免疫病史及家族史。本研究通過山西醫科大學第二醫院倫理委員會批準，所有病人均簽署知情同意書。

1.2 研究方法

1.2.1 資料收集 收集所有病人的一般資料(性別、年齡、病程)；臨床特征(肌痛、肌無力、肺間質病變、關節痛、雷諾現象)及自身抗體(抗ANA抗體、抗Jo-1抗體、抗Mi-2抗體、抗SRP抗體、抗Ro-52抗體)；實驗室資料[紅細胞沉降率(ESR)、C反應蛋白(CRP)、丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉移酶(AST)、肌酸激酶(CK)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)、乳酸脫氫酶(LDH)、α-羥丁酸脫氫酶(HBDH)]。其中，ESR采用魏氏法檢測，CRP、ALT、AST、CK、CK-MB、LDH、HBDH采用全自動生化分析儀檢測。

1.2.2 CD4+T淋巴細胞亞群的測定 ①Th1、Th2、Th17細胞培養與標記：取80 μL抗凝血分別加入刺激劑10 μL PMA工作液(終濃度30 ng/mL)、10 μL Ionomycin工作液(終濃度750 ng/mL)和1 μL GolgiStop，37 ℃二氧化碳(CO2)培養箱刺激5 h。將細胞分成兩管，A管和B管均加入抗人CD4-FITC，室溫避光孵育30 min后，各管分別加入新鮮配制的Fixation/Permeabilization液1 mL渦旋混勻，4 ℃避光孵育30 min后，A管加入白細胞介素(IL)-4-PE和γ干擾素(IFN-γ)-抗原遞呈細胞(APC)，B管加入抗人IL-17-PE，室溫避光孵育30 min后，磷酸緩沖鹽溶液(PBS)洗滌，上機檢測。②調節性T細胞(Treg細胞)標記：取80 μL抗凝血加入CD4-FITC和CD25-APC，室溫避光孵育30 min后，各管分別加入新鮮配制的Fixation/Permeabilization液1 mL渦旋混勻，4 ℃避光孵育30 min后，加入抗人叉頭蛋白P3(FOXP3)抗體，室溫避光孵育30 min后，PBS洗滌后，上機檢測。③流式細胞儀測定：24 h內上流式細胞儀(Calibur，BD，USA)測定分析結果。根據前向角散射光(FSC)對側向角散色光(SSC)的散點圖對淋巴細胞設門區分淋巴細胞，以CD4對SSC設門區分Th細胞(CD4+)，取門內1×104個細胞，以CellQuest軟件獲取、分析相對百分數。

2 結 果

2.1 各組一般資料比較 CAM組發病年齡高于DM組、PM組及健康對照組，差異均有統計學意義(P<0.05)；各組性別、病程比較差異無統計學意義(P>0.05)。詳見表1。

表1 各組一般資料比較

2.2 3組病人臨床特點及自身抗體比較 3組病人肌痛、肌無力、關節痛、抗ANA抗體、抗Mi-2抗體、抗SRP抗體及抗Ro-52抗體比較差異均無統計學意義(P>0.05)。CAM組肺間質病變、雷諾現象及抗Jo-1抗體陽性發生率低于DM組、PM組(P<0.05)；DM組肺間質病變發生率高于PM組(P<0.05)，而雷諾現象、抗Jo-1抗體陽性發生率與PM組比較差異均無統計學意義(P>0.05)。詳見表2、表3。

表2 3組病人臨床特點比較 單位：例(%)

表3 3組病人自身抗體比較 單位：例(%)

2.3 實驗室指標比較

2.3.1 3組病人炎性指標及心肌酶譜比較 CAM組ESR水平明顯高于DM組、PM組(P<0.05)，而DM組、PM組ESR比較差異無統計學意義(P>0.05)。3組CRP、ALT、AST、CK、CK-MB、LDH、HBDH水平比較差異均無統計學意義(P>0.05)。詳見表4、表5。

表4 3組病人外周血實驗室指標比較 [ M(Q1，Q3)]

表5 3組病人心肌酶譜比較 [ M(Q1，Q3)] 單位：U/L

2.3.2 各組外周血淋巴細胞亞群比較 與健康對照組比較，DM組、PM組、CAM組外周血T細胞、自然殺傷(NK)細胞、CD4+T細胞、CD8+T細胞、輔助性T淋巴細胞(Th)1、Th17及調節性T細胞(Treg細胞)計數均明顯減少(P<0.05)，外周血B細胞、Th2細胞計數及Th17/Treg差異均無統計學意義(P>0.05)。CAM組外周血NK細胞、Treg細胞計數明顯低于DM組、PM組(P<0.05)。詳見表6、表7。

表6 各組外周血淋巴細胞亞群水平比較 [ M(Q1，Q3)] 單位：個/μL

表7 各組外周血CD4+T淋巴細胞亞群水平比較 [ M(Q1，Q3)]

2.3.3 3組細胞因子水平比較 DM組、PM組、CAM組外周血IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)水平比較差異無統計學意義(P>0.05)。CAM組外周血IFN-γ水平明顯低于DM組、PM組(P<0.05)，但DM組、PM組IFN-γ水平比較差異無統計學意義(P>0.05)。詳見表8。

表8 3組細胞因子水平比較 [ M(Q1，Q3)] 單位：pg/mL

3 討 論

IIMs是一組全身性自身免疫性疾病，其特征為骨骼肌的慢性炎癥，以DM和PM最為常見。傳統觀點認為自身免疫性疾病的發病機制是由于效應T細胞的過度激活引起的，近年來，由Treg細胞數量和功能失衡引起的免疫耐受被認為是自身免疫性疾病的關鍵起源。且目前已有大量研究證實免疫平衡的破壞是IIMs發病的主要原因[6-8]。因此，分析外周血淋巴細胞亞群有助于了解病人機體的免疫功能，為免疫治療提供依據。

本研究結果顯示，DM、PM、CAM病人外周血淋巴細胞各亞群如T淋巴細胞、NK細胞、CD4+T細胞、CD8+T細胞、Th1、Th17及Treg細胞絕對計數均低于健康對照組，表明外周血淋巴細胞亞群可能參與DM、PM、CAM的發病過程，提高外周血淋巴細胞水平有助于改善病人免疫功能，與孫何花[9]的研究結果一致。本研究還發現，相較DM、PM病人，CAM病人外周血Th17細胞水平基本相近，而Treg細胞絕對計數卻明顯減少，提示Treg細胞在CAM微環境中對腫瘤的發展可能起抑制作用，其作用機制涉及Foxp3+Treg細胞可重編程分化為效應性T細胞，從而使抗腫瘤免疫表達增強[10]，或通過抑制炎癥驅動惡性轉化的過程以保護機體免受惡性腫瘤的侵害[11]。因此，本研究得出Treg耗竭治療策略可能不適用于CAM，相反，升高Treg細胞水平的靶向免疫治療或許可延緩CAM進展，有待進一步深入研究。

干擾素(interferon，IFN)是一組多效性細胞因子，可激活樹突狀細胞和淋巴細胞并調節細胞的分化、增殖與凋亡，在機體免疫應答、宿主抵抗病毒細菌感染以及腫瘤監測中發揮重要作用[12]。IFN-γ是Ⅱ型IFN的唯一成員，其受體由IFN-γR1和IFN-γR2亞基組成[13-14]，主要來源于NK細胞、CD4-Th1和CD8細胞毒性T淋巴細胞[15]，可調節多種免疫細胞類型的分化和功能。本研究發現，與DM、PM病人比較，CAM病人外周血IFN-γ水平明顯降低，提示在免疫失衡基礎上，IFN-γ水平降低可能參與CAM的發生，與Huffaker等[16-17]研究結果腫瘤微環境中IFN-γ的表達減慢了腫瘤的生長相一致。其機制可能為通過抑制腫瘤細胞周期，誘導腫瘤缺血以及激活APC和效應細胞從而抑制腫瘤生長[18]，表明IFN-γ在監測和消除腫瘤細胞中起重要作用。那么干擾IFN-γ的表達水平或許可減少CAM的發生，為其治療提供新思路。

本研究中，105例病人發病年齡以CAM病人較高，表明年齡較大可能是CAM發生的危險因素，與Lu等[19-20]研究結果相似。CK對于IIMs病人而言敏感性高，特異性差，其升高的程度與肌肉損傷程度平行，但也有少數病人活動期CK水平可以正常[21]。本研究中，CAM病人雷諾現象、抗Jo-1抗體陽性發生率低于DM、PM病人，而ESR明顯高于DM、PM病人，表明雷諾現象、抗Jo-1抗體陽性是CAM發生的保護因素，而ESR增快可增加其發生風險。此外，本研究還發現3組病人關節痛、肌痛癥狀及血清CK水平比較差異均無統計學意義(P>0.05)，可能與樣本量及病情活動有關。間質性肺疾病被認為是IIMs最常見的系統性并發癥之一[22]，與預后較差和死亡率增加相關[23-24]。Hallowell等[22]報道PM、DM合并間質性肺疾病的病例數占19.9%～78.0%。本研究結果顯示，DM、PM、CAM合并間質性肺疾病的百分比依次為66.07%、41.67%、16.00%，以CAM合并間質性肺疾病最少，表明CAM病人與伴有間質性肺疾病的減少相關，這與Zhang等[25]的Meta分析發現惡性腫瘤與合并間質性肺疾病的風險降低一致。有研究發現促炎細胞因子(如IL-6)可刺激中性粒細胞和淋巴細胞，進而引起肺泡上皮細胞損傷[26]。DM病人較易合并間質性肺疾病，可能與其外周血中IL-6水平的較高表達有關。本研究中所有伴發間質性肺疾病病人均采用高分辨率CT(HRCT)診斷，既往研究證實肺活檢組織學改變與HRCT的檢查結果一致[27]，且HRCT診斷具有高特異性，高達90%[28]，故早期DM病人應更加注重HRCT檢查以明確有無間質性肺疾病的發生。

綜上所述，DM、PM、CAM病人外周血淋巴細胞亞群存在免疫失衡，Treg細胞和IFN-γ的水平降低可能參與CAM的發生，提示靶向調節外周血淋巴細胞和細胞因子水平有助于改善病人免疫功能，而預測CAM發生的風險因素將有助于提早干預，有望為DM、PM、CAM致病機制的進一步探究及提高診治率提供新思路。