化生性乳腺癌免疫微環境中中性粒細胞浸潤和PD-L1表達及臨床病理意義

胡 月，程嵐卿，王 弦,2，王志皓，吳 強,2

化生性乳腺癌(metaplastic breast cancer, MBC)是一組異質性腫瘤，其特征是腫瘤性上皮向鱗狀細胞和(或)間葉樣成分分化，包括但不限于梭形細胞、軟骨樣和骨樣細胞[1]。MBC往往伴有浸潤性導管癌非特殊型(invasive ductal carcinoma of no special type, IDC-NST)成分。目前對于MBC的化生亞型與預后的關系仍存在爭議。MBC整體生存率不佳，容易出現局部復發與遠處轉移，且目前尚無有效的預后指標[2]。

本課題組前期研究顯示，乳腺癌中腫瘤相關中性粒細胞(tumor-associated neutrophils, TANs)浸潤與乳腺癌患者無瘤生存期呈負相關[3]。既往研究發現，胃癌中腫瘤衍生的粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子通過Janus激酶(JAK)信號轉導因子和轉錄激活因子3(STAT3)信號通路，激活胃癌中浸潤的中性粒細胞，并表達高水平細胞程序性死亡-配體1(programmed cell death-ligand 1, PD-L1)，進而抑制正常T細胞免疫反應，并且在體內促進胃癌的生長和發展[4]。MBC中尚無關于TANs和PD-L1相關性的研究，因此，本實驗利用免疫組化法檢測MBC中TANs的浸潤情況與PD-L1的表達，分析TANs和PD-L1表達的關系，探究TANs與PD-L1在MBC中的作用及其臨床病理意義。

1 材料與方法

1.1 材料收集2011～2020年安徽醫科大學第一附屬醫院和安徽醫科大學第二附屬醫院存檔的47例MBC手術切除標本，所有患者術前均未行新輔助化療，并經復查核實。所有腫瘤診斷標準參照WHO(2019)MBC組織學分型。根據腫瘤成分類型分類：鱗狀細胞癌22例、梭形細胞癌5例、低級別腺鱗癌1例、伴異源性間葉樣分化型9例、混合型10例(含兩種及兩種以上化生成分)。此外，47例MBC中同時具有化生成分和NST成分有41例。MBC患者中位年齡51.6歲。對患者進行隨訪，每半年隨訪1次，隨訪方式為查詢門診病歷或電話隨訪。當患者出現腫瘤轉移、復發或死亡等事件時作為隨訪終點，隨訪截至2020年8月。

1.2 試劑鼠抗人CD66b單克隆抗體(G10F5，BD Pharmingen公司)，抗人PD-L1兔單克隆抗體(SP142，Abcam公司)，小鼠/兔聚合法檢測通用性試劑盒(北京中杉金橋公司、美國羅氏公司)，DAB顯色試劑盒(北京中杉金橋公司、美國羅氏公司)。

1.3 方法所有組織均經10%中性福爾馬林固定、石蠟包埋。蠟塊經4 μm厚連續切片，分別行HE和免疫組化染色。應用CD66b標記TANs，采用EnVision兩步法進行免疫組化染色；通過Roche BenchMark XT全自動免疫組化儀半抗原及Optiview增強放大系統對癌組織進行PD-L1染色。

1.4 結果判讀免疫組化結果判讀由兩名病理醫師采用雙盲法對染色切片進行全面觀察，判讀結果取平均值。TANs計數[3]：以中性粒細胞胞膜及胞質強染色為陽性，計數10個高倍鏡視野MBC中化生成分癌實質浸潤的CD66b陽性中性粒細胞總數作為其浸潤密度。以TANs浸潤密度的中位數作為區分TANs浸潤高、低密度的指標。PD-L1判讀[5]：以細胞膜及細胞質出現棕黃色點狀或線狀染色為陽性，采用IC計數法評估免疫細胞(包括淋巴細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞和粒細胞)染色結果，即任何強度的PD-L1陽性免疫細胞所占腫瘤面積的比例≥1%為陽性。

1.5 統計學分析采用GraphPad(Prism 5.0)和SPSS 23.0軟件進行統計學處理。連續變量的差異分析采用Mann-WhitneyU檢驗，樣本率之間的比較采用卡方檢驗或費舍爾精確檢驗，應用Spearman等級相關檢驗進行相關性分析。用Kaplan-Meier曲線和對數秩檢驗進行生存分析。使用SPSS 23.0軟件進行多因素Cox回歸分析。P<0.05被認為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 MBC中TANs浸潤及PD-L1的表達在MBC化生成分癌實質及癌間質均觀察到TANs浸潤。癌實質TANs浸潤密度為0～283.0，浸潤密度中位數為4.0。其中低密度TANs組中位數為1.0，平均數為1.4±1.0；高密度組中位數為36.0，平均數為68.2±76.7(圖1～3)。癌間質TANs浸潤密度中位數為1.0，化生成分癌實質TANs浸潤密度高于癌間質，差異具有統計學意義(P<0.05，圖4)。PD-L1在單一化生成分型MBC中的陽性率32.4%(12/37)，在混合化生成分型中的陽性率90.0%(9/10)，差異具有統計學意義(P<0.05，表1)。本實驗對TANs浸潤密度和PD-L1表達情況進行了自身對照，41例同時具有化生成分和NST成分病例中，化生成分中的TANs浸潤密度高于NST成分(P<0.05，圖5)，化生成分中的PD-L1陽性率高于NST成分(P<0.05，表2)。

圖1 CD66b和PD-L1在鱗狀細胞癌中的表達：A. HE染色；B. 浸潤的TANs，EnVision兩步法；C. PD-L1表達，Roche BenchMark XT全自動免疫組化 圖2 CD66b和PD-L1在梭形細胞癌中的表達：A. HE染色；B. 浸潤的TANs，EnVision兩步法；C. PD-L1表達，Roche BenchMark XT全自動免疫組化 圖3 CD66b和PD-L1在伴軟骨樣成分分化型MBC中的表達：A. HE染色；B. 浸潤的TANs，EnVision兩步法；C. PD-L1表達，Roche BenchMark XT全自動免疫組化

表1 MBC中TANs密度和PD-L1表達與臨床病理特征的關系[n(%)]

圖4 MBC癌實質和癌間質的TANs浸潤密度差異

圖5 TANs在MBC化生成分癌實質與NST成分癌實質中的浸潤情況

表2 MBC化生成分和NST成分的PD-L1表達情況

2.2 TANs浸潤密度、PD-L1表達與MBC臨床病理特征的關系在MBC癌組織中，TANs高密度浸潤與患者年齡>50歲、TNM高分期、遠處轉移、ER陰性、高Ki-67增殖指數呈正相關(P<0.05，表1)；PD-L1陽性與HER-2過表達呈正相關(P<0.05，表1)。生存分析顯示，TANs浸潤密度與患者3年無進展生存期(progression-free survival, PFS)呈負相關(P<0.01，圖6A)，PD-L1表達與患者3年PFS無相關性(P>0.05，圖6B)。MBC患者3年PFS的Cox多因素分析顯示，MBC中TANs浸潤密度與3年PFS密切相關(P<0.05，表3)，是較差的PFS獨立危險因素。TANs浸潤密度與PD-L1表達呈正相關(rs=0.309，P<0.05，圖7)。

圖6 A. TANs浸潤密度與患者PFS的關系；B. PD-L1表達與患者PFS的關系

圖7 MBC癌組織中TANs浸潤密度與PD-L1表達的相關性

表3 MBC患者3年PFS的Cox多因素分析

3 討論

腫瘤微環境(tumor microenvironment,TME)是決定腫瘤生物學行為的關鍵因素之一[6]。TME包括多種免疫細胞、非免疫細胞和腫瘤細胞[7]。MBC雖然被視為一種具有相對免疫原性的乳腺癌，但研究表明，MBC的TME存在豐富的免疫細胞如腫瘤浸潤淋巴細胞、中性粒細胞等浸潤，并影響其腫瘤進展與預后[8]。

中性粒細胞是抵抗感染和損傷的第一道防線。過去認為，TME中中性粒細胞可能是防御性免疫反應的指標，然而最新研究顯示TANs可以增強局部腫瘤的生長、促進腫瘤進展和轉移[9]。TANs分泌的彈性蛋白酶(neutrophil elastase, NE)在TME中可以降解胰島素受體底物1，進而加強磷脂酰肌醇激酶(PI3K)和血小板源性生長因子受體之間的相互作用，促進癌細胞的增殖[10]。中性粒細胞釋放的細胞外陷阱(neutrophil extracellular traps, NETs)也能促進腫瘤細胞的增殖。NETs是由具有金屬蛋白酶的DNA支架和活化的中性粒細胞釋放的蛋白質組成的網狀結構，NETs可直接影響腫瘤細胞，通過激活NF-κB等信號傳導途徑或通過NETs中的NE等蛋白酶促進其增殖[11]。NETs還能促進腫瘤轉移、擴散。在小鼠結腸癌實驗中發現，NETs在體外通過激活小鼠結腸癌細胞中TLR9生長信號通路釋放高遷移率族蛋白B1，從而促進了癌細胞的遷移和侵襲[12]。Park等[13]的研究亦印證了這點，在小鼠三陰型乳腺癌肺轉移病灶中NETs的陽性率高于原發病灶，并且使用脫氧核糖核酸酶Ⅰ抑制NETs的形成可以顯著減少小鼠三陰型乳腺癌的肺轉移。本組中，TANs高密度浸潤MBC組相對于TANs低密度浸潤MBC組具有更高的Ki-67增殖指數。這表明，MBC中TANs浸潤密度和癌細胞增殖密切相關，進一步證實了TANs可能會促進癌細胞增殖。此外，本組病例中出現遠處轉移的6例患者均伴隨TANs高密度浸潤(6/6)，明顯高于未轉移患者。這表明TANs高密度浸潤與腫瘤轉移呈正相關，TANs在MBC遠處轉移過程可能發揮重要作用。

TANs除了促進MBC癌細胞增殖與轉移，還與MBC的PFS密切相關。在本組中，TANs高密度浸潤與ER陰性、高TNM分期呈正相關，與PFS呈負相關，這一結果與既往研究一致[14]。多因素分析顯示，TANs浸潤密度與3年PFS密切相關，浸潤密度越高，患者出現腫瘤進展的風險越大。這表明，TANs高密度浸潤與MBC進展密切相關，有望成為一個潛在的MBC生物學標志物。這也為MBC中針對中性粒細胞的靶向治療提供新思路。

TANs還可以通過上調PD-L1表達，抑制T細胞增殖從而抑制腫瘤免疫反應。Shang等[15]研究證實卵巢癌中HOXA轉錄本可以促進中性粒細胞分泌白介素-6，上調PD-L1表達，從而抑制T細胞免疫反應，最終加速卵巢癌細胞的免疫逃逸。

乳腺癌中PD-L1表達通常與預后不良的臨床病理特征呈正相關。如在一項關于PD-L1與乳腺癌臨床病理特征的Meta分析中發現，PD-L1陽性與HER-2過表達密切相關[16]。本組中PD-L1陽性與HER-2過表達亦呈正相關。有研究表明HER-2過表達與MBC的惡性特征直接相關[17]。此外，PD-L1在存在一種以上化生成分MBC中的陽性率高于單一化生成分型MBC，而存在一種以上化生成分是MBC中無復發和特異性生存率的不良因素之一[18]。盡管本組中PD-L1表達與患者預后無明顯相關性(或與樣本量過少有關)，但PD-L1表達與MBC的惡性特征呈正相關，這提示PD-L1可能影響MBC的進展，也為開展免疫檢查點抑制劑(immune checkpoint inhibitors, ICIs)如PD-1/PD-L1抑制劑的免疫治療提供證據。Al Sayed等[19]在1例轉移性MBC中聯合使用抗PD-L1抗體(durvalumab)與化療藥物紫杉醇，治療效果良好且副作用小。此外ICIs在MBC中的治療效果已進入臨床研究(NCT02834013)。本組中PD-L1的陽性率為44.7%(21/47)，與既往MBC研究中PD-L1的陽性率47.6%大致相符[8]。這提示接近一半對放化療反應不佳的MBC患者可能從ICIs治療中獲益。

研究證實腫瘤組織中中性粒細胞的浸潤密度與PD-L1表達呈正相關，如膽管細胞癌中TANs密度與PD-L1表達呈正相關[20]。本實驗發現，MBC中TANs浸潤密度與PD-L1表達呈正相關，與上述研究結果一致。這提示TANs與PD-L1可能共同參與MBC的進展，影響MBC患者的預后。此外，針對中性粒細胞的靶向治療還可以協助PD-1/PD-L1抑制劑發揮治療作用。Kargl等[21]研究小鼠肺非小細胞肺癌時發現，中性粒細胞抑制劑可協助PD-1抑制劑攻擊肺癌細胞，使癌灶體積縮小，延緩腫瘤產生耐藥性的時間，這提示中性粒細胞抑制劑也許是ICIs有效的輔助治療手段。

綜上所述，化生成分癌實質中浸潤的TANs與MBC進展及PD-L1表達呈正相關，有望成為MBC無進展生存率的潛在生物學標志物。