氨基酸分析法測定抗HPV功能性婦科敷料中β-乳球蛋白的含量

【作 者】張曉萌，傅俊，王康俊，王巨才

海南省藥品檢驗所，海南省藥物質量研究重點實驗室，海口市，570216

0 引言

近年來，國家藥品監督管理局和各省級藥品監督管理局陸續批準了多批抗HPV生物蛋白敷料的生產許可，此類抗HPV生物蛋白敷料是通過生物蛋白敷料預防和阻斷生殖道HPV感染，用于宮頸癌前病變（CIN）及宮頸癌的臨床治療。抗HPV生物蛋白敷料經臨床驗證，在單獨和聯合治療高危型HPV感染時獲得的轉陰率和有效率均優于保婦康栓、重組人干擾素等早期上市產品，能夠有效降低宮頸癌的發病率，使用期間無明顯不良反應，可作為抗高危型HPV感染的首選用藥[1-8]。

抗HPV生物蛋白敷料為第二類醫療器械，主要成分為生物蛋白、卡波姆、防腐劑等。生物蛋白是抗HPV生物蛋白敷料中阻斷HPV感染的有效成分，來源于牛乳、羊乳中的乳清蛋白，是利用現代工藝技術從乳制品中提取的一類蛋白質，具有抗癌、免疫調節、提高記憶力等作用[9]。β-乳球蛋白占乳清蛋白總量的44%～50%，是乳清蛋白的主要生物活性成分。因此，準確檢測抗HPV生物蛋白敷料中的β-乳球蛋白含量，對測定抗HPV生物蛋白敷料中的有效成分含量，完善其質量標準，確保產品的有效性具有重要意義。

目前，β-乳球蛋白常用的檢測方法主要有凝膠電泳法（SDS-PAGE）[10]、毛細管電泳法（CE）[11-12]、反相高效液相色譜法（RPHPLC）[13]、超高效液相色譜-三重四級桿質譜聯用法（LC-MS/MS）[14]和二喹啉甲酸試劑盒法（BCA）[15]等。上述檢測方法在檢測周期、檢測成本、操作過程等方面都存在一定缺陷。筆者應用氨基酸分析法，在酸性條件下將β-乳球蛋白水解為游離氨基酸，采用陽離子交換色譜分離，茚三酮柱后衍生，采集570 nm波長下色譜圖，通過測定水解獲得的賴氨酸含量，間接測定樣品中β-乳球蛋白的含量[16-18]。經驗證，采用筆者建立的檢測方法，酸性條件下裂解β-乳球蛋白共得到賴氨酸等12種氨基酸，將測得的各氨基酸加和，與實際稱量的β-乳球蛋白標準物質蛋白含量基本一致，說明該實驗方法可以將β-乳球蛋白完全裂解為游離氨基酸并通過柱后衍生法測得[19]。

1 材料

1.1 儀器與試劑

S4300型氨基酸分析儀（Sykam公司）；XS205型電子天平（Mettler-Toledo公司）；ED23型電熱干燥箱（Binder公司）。

1.2 藥品與試劑

抗HPV生物蛋白敷料（海南眾康悅醫療器械有限公司，批號:20200601、20200602、20200603、20200801、20200802、20200803，規格：0.1 mg/g）；β-乳球蛋白對照品（Sigma-Aldrich 公司，批號：SLCF 4944，純度≥99.7%）；流動相A和流動相B均購自Sykam公司；鹽酸（西隴科學股份有限公司，分析純）；水合茚三酮（上海麥克林生化科技有限公司，分析純）；水為純化水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

采用陽離子交換色譜柱（LCA K06/Na柱，4.6×150 mm）；流動相：流動相A（稱取檸檬酸三鈉11.9 g、檸檬酸6 g、苯酚1 g，置于1 L量瓶中，加適量水溶解，再加65 mL甲醇和6 mL濃鹽酸，加水定容，調pH至3.4）；流動相B（稱取檸檬酸三鈉11.9 g、氫氧化鈉2.8 g、苯酚1 g、硼酸5 g，置于1 L量瓶中，加水溶解并定容，調pH至10.8），采用梯度洗脫（0～2.5 min，100%A；2.5～11 min，100%→85% A；11～17 min，85%→80% A；17～23.3 min，80%→67% A；23.3～30.4 min，67%→20% A；30.4～45.1 min，20%→0 A）；衍生液（茚三酮溶液）流速0.25 mL/min；檢測波長：570 nm；柱后反應器溫度130 ℃；進樣量：50 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液

精密稱取β-乳球蛋白對照品20 mg，置20 mL頂空瓶中，加6 mol/L鹽酸溶液5 mL，充氮密封，置105 ℃下裂解24 h，取出放置至室溫，將所得溶液用1 mol/L鹽酸溶液完全轉移至100 mL量瓶中，并稀釋定容至刻度，搖勻，作為對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液

精密稱取抗HPV生物蛋白敷料樣品2.0 g，置20 mL頂空瓶中，加6 mol/L鹽酸溶液5 mL，充氮密封，置105 ℃下裂解24 h，取出放置至室溫，將所得溶液用4 mol/L氫氧化鈉溶液完全轉移至10 mL量瓶中，并稀釋定容至刻度，搖勻，作為供試品溶液。

2.3 系統適用性試驗

取“2.2.1”項下對照品溶液適量，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖，結果如圖1所示。結果表明，在570 nm波長處，對照品溶液中的賴氨酸和其他相鄰氨基酸分離良好。

圖1 對照品溶液典型色譜圖Fig.1 Typical chromatogram of reference solution

2.4 線性關系考察

精密稱取β-乳球蛋白對照品適量，以1 mol/L鹽酸溶液定量稀釋成每1 mL含β-乳球蛋白（77.28、135.24、193.20、251.16、309.12）μg的系列對照品溶液，按“2.1”項下色譜條件分別精密量取50 μL注入氨基酸分析儀，記錄色譜圖中賴氨酸相應色譜峰面積。以賴氨酸的峰面積（y）為縱坐標、β-乳球蛋白濃度（x,μg/mL）為橫坐標進行線性回歸，繪制標準曲線，得回歸方程y=5.060x+4.278（r=0.999 7）。結果表明，β-乳球蛋白檢測濃度線性范圍為77.28～309.12 μg/mL。

2.5 檢測限和定量限

按“2.1”項下色譜條件進樣50 μL，記錄峰面積并計算β-乳球蛋白濃度，當信噪比為3時檢測限為0.1 μg/mL；當信噪比為10時定量限為2 μg/mL。

2.6 精密度試驗

精密吸取“2.2.1”項下對照品溶液適量，按“2.1”項下色譜條件注入氨基酸分析儀，連續進樣6次，測定峰面積。結果表明，峰面積的RSD=0.55%（n=6），儀器精密度良好。

2.7 穩定性試驗

取“2.2.2”項下供試品溶液，分別于室溫（20～25℃）下放置（0、1、2、6、8、12）h按“2.1”項下色譜條件進行測定，記錄賴氨酸峰面積，按外標法計算樣品中β-乳球蛋白的含量。結果，β-乳球蛋白含量的RSD=1.1% (n=6)，表明供試品溶液12 h內穩定性良好。

2.8 重復性試驗

精密稱取同一批號樣品適量，按“2.2.2”項下方法平行制備6份供試品溶液，分別按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，按外標法計算含量。結果，β-乳球蛋白平均含量為0.114‰,RSD=0.51% (n=6)，表明本方法重復性良好。

2.9 加樣回收率試驗

精密稱取抗HPV生物蛋白敷料的空白輔料共9份，分別置于50 mL量瓶中，分別加入低、中、高濃度（處方量80%、100%、120%）的β-乳球蛋白對照品，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算加樣回收率，結果如表1所示。

表1 加樣回收率實驗結果（n=9）Tab.1 Results of recovery test（n=9）

2.10 樣品含量測定結果

精密稱取6批（20200601、20200602、20200603、20200801、20200802、20200803）樣品和對照品適量，分別按“2.2.1”、“2.2.2”項下方法平行制備供試品溶液和對照品溶液，再分別按“2.1”項下色譜條件注入氨基酸分析儀，記錄賴氨酸峰面積，按外標法以峰面積計算樣品中β-乳球蛋白含量，測得樣品中平均含量為0.115‰、0.114‰、0.118‰、0.116‰、0.113‰、0.115‰。

3 討論

3.1 最佳酸性水解條件

因為蛋白質樣品在酸水解過程中會造成氨基酸不同程度的破壞，不同的水解溫度和時間對氨基酸含量的測定有一定影響，筆者考察了不同酸性水解條件下（水解溫度為105、110 ℃，裂解時間為16 h、20 h、24 h、28 h）β-乳球蛋白對照品的回收率，結果見表2。考慮到酸水解對氨基酸的破壞，排除回收率超過100%的水解條件，選擇最接近100%的105 ℃、24 h作為本次實驗的水解條件。

表2 最佳酸性水解條件考察Tab.2 Study on optimum acid hydrolysis conditions

3.2 標志氨基酸的選擇

取β-乳球蛋白進行酸性水解后得到多種游離氨基酸，在570 nm處可檢測到門冬氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、谷氨酸、丙氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、組氨酸、賴氨酸、精氨酸共12種氨基酸，綜合靈敏度、分離效果及專屬性等多種因素，最終選定以賴氨酸作為標志氨基酸進行定量測定。

3.3 與其他方法的比較

目前，β-乳球蛋白常用的檢測方法主要有凝膠電泳法（SDS-PAGE）、毛細管電泳法（CE）、反相高效液相色譜法（RP-HPLC）、超高效液相色譜-三重四級桿質譜聯用法（LCMS/MS）和二喹啉甲酸試劑盒法（BCA）等。抗HPV功能性婦科敷料中β-乳球蛋白的含量為0.1‰，因此對定量分析方法的靈敏度、精密度等提出了更高的要求。取6批樣品（20200601、20200602、20200603、20200801、20200802、20200803）和對照品各適量，進行含量測定，結果顯示，SDS-PAGE 法和CE 法的定量限較高，不能滿足該產品定量分析的要求；RP-HPLC法處理步驟較為繁瑣，分離度和專屬性較低；LCMS/MS法，靈敏度高、選擇性好，檢測成本較高，精密度和重復性不及RP-HPLC法；BCA法，靈敏度高、選擇性好，重復性欠佳。結果如表3所示。

表3 樣品含量測定Tab.3 Determination of the content of sample

氨基酸分析法與上述幾種檢測方法比較，操作簡單、專屬性強、準確率高、重復性好，通過對樣品方法學研究，結果顯示，該方法適合于抗HPV功能性婦科敷料中β-乳球蛋白的定量分析。