心血管疾病中環(huán)狀RNA的研究現(xiàn)狀

曾曉輝 盧帥 汪朝暉

環(huán)狀RNA(circular RNA,circRNA)是一種天然合成的非編碼RNA，可在機體各類組織中表達，是近年非編碼RNA研究領域的熱點分子。與其他普通RNA不同的是，circRNA中不含 5’末端帽子結(jié)構(gòu)和3’多聚腺苷酸尾結(jié)構(gòu)，而是一種共價閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)，因此circRNA不易受核酸外切酶分解，在各類組織細胞中表達更加穩(wěn)定[1]。近年來，隨著實驗技術(shù)和高通量測序的普及，使得circRNA的分離和鑒定變得更加簡便。越來越多的研究表明，circRNA具有重要的生物學功能，可在各種疾病如神經(jīng)系統(tǒng)疾病、癌癥、心血管疾病、免疫系統(tǒng)疾病中差異表達并發(fā)揮作用[2]。目前大量研究證實，circRNA在心肌梗死(mgocardial infarction,MI)、心臟衰老、心肌病、心肌纖維化等心血管疾病的發(fā)生發(fā)展中起重要作用[3]。本文將對circRNA在心血管領域中的最新研究現(xiàn)狀進行綜述。

1 CircRNA的概述

1.1 CircRNA的發(fā)現(xiàn)及生物合成 20世紀70年代，circRNA第一次被科學家在植物感染的病毒中所發(fā)現(xiàn)，并被認為是由于錯誤的可變剪接而導致了circRNA的產(chǎn)生[4,5]。Capel等[6]于1993年在哺乳動物中偶然發(fā)現(xiàn)了circRNA的大量存在。直到2012年，由于整個RNA測序(RNA-seq)技術(shù)和生物信息學技術(shù)的高速發(fā)展，真核生物中circRNA的豐度和普遍性才得到認可。circRNA的合成機制目前尚未完全闡明，通常認為其是通過反向剪接而生成的，反向剪接是將下游的5’剪接位點與上游的3’剪接位點通過共價鍵連接形成外顯子環(huán)狀RNA[7]。同時，Jeck等[7]提出了兩種通過反向剪接的circRNA生物合成模型，即“套索前體模型”和“內(nèi)含子配對介導的環(huán)化模型”。此外，Zhang等[8]已經(jīng)證明外顯子環(huán)化取決于側(cè)翼內(nèi)含子互補序列，而且外顯子環(huán)化效率可以通過側(cè)翼內(nèi)含子之間或單個內(nèi)含子內(nèi)部的RNA配對之間的競爭來調(diào)節(jié)。Liang等[9]研究發(fā)現(xiàn)含有剪接位點以及短反向重復序列的微型內(nèi)含子足以使中間的外顯子在細胞中環(huán)化。以上兩項研究均為環(huán)狀RNA的兩種生物合成模型提供了證據(jù)。根據(jù)circRNA的組成可將其分為以下3類：外顯子circRNA(ecircRNA)、內(nèi)含子circRNA(ciRNA)以及外顯子-內(nèi)含子雜合circRNA(EIciRNA)[10]。

1.2 CircRNA的特性 circRNA具有以下幾個主要的特性：(1)circRNA是廣泛表達于人類細胞中的非編碼RNA，其表達量是mRNA的10倍以上[7]。(2)由于circRNA的閉環(huán)結(jié)構(gòu)，導致其被核酸酶降解的較少，比線性RNA更穩(wěn)定。(3)絕大多數(shù)circRNA序列在物種之間具有高度保守性[7，11]。(4)絕大多數(shù)circRNA位于細胞質(zhì)中，只有一小部分位于細胞核[12]。(5)主要來自于外顯子，其他一小部分來自內(nèi)含子或內(nèi)含子片段。(6)circRNA表達通常具有細胞、組織以及發(fā)育階段特異性[13]。

1.3 CircRNA的生物學功能 起初circRNA被科學家當作是由于機體錯誤的可變剪接而產(chǎn)生的“轉(zhuǎn)錄噪音”，因此未引起研究人員的足夠重視[5]。隨著人們對非編碼RNA研究領域的不斷深入，circRNA的生物學功能也逐漸被人們所揭曉。其主要功能包括以下幾個方面：(1)circRNA充當微小RNA(microRNA)海綿發(fā)揮功能；(2)參與RNA轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)；(3)通過與蛋白質(zhì)相互作用發(fā)揮功能；(4)circRNA具有蛋白翻譯功能。其中，circRNA作為內(nèi)源性競爭性RNA發(fā)揮miRNA海綿的功能最為人們所熟知。大量研究表明，具有互補序列的環(huán)狀RNA可以海綿樣吸附miRNA，抑制其下游基因的表達，從而參與各種疾病的發(fā)生發(fā)展[14，15]。最近的一些研究發(fā)現(xiàn)，circRNA也可通過與蛋白質(zhì)直接相互作用從而調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的亞細胞定位、穩(wěn)定性以及蛋白質(zhì)功能[16]。長期以來，人們一直認為circRNA是作為一種非編碼RNA的身份來參與各種生物學過程，近期研究發(fā)現(xiàn)circRNA也具備翻譯功能，并且所得的肽還在人類疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮生物學作用[17]。但是目前學術(shù)界關于circRNA的蛋白翻譯功能仍然存在一些爭議，一些研究人員認為circRNA由于其特殊的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，使得蛋白翻譯時同一開放閱讀框的起點和終點相互靠近，導致翻譯過程的起始和終止發(fā)生在同一位置，翻譯效率不高[18]。

1.4 研究CircRNA的常用數(shù)據(jù)庫 隨著非編碼RNA研究的興起，科研工作者早已開發(fā)了許多關于非編碼RNA相關的公共數(shù)據(jù)庫以供研究人員獲取相關數(shù)據(jù)和信息。其中，CircBase可用于查找circRNA的基本注釋信息[19]；StarBasev2.0 and CircInteractome可用來預測與circRNA相互作用的miRNA以及RNA結(jié)合蛋白[20,21]；TRCirc提供了circRNA轉(zhuǎn)錄的調(diào)控信息[22]；CircRNADb和CSCD這兩個在線數(shù)據(jù)庫則可用于預測特定circRNA的蛋白編碼能力[23,24]；Circ2Traits則提供了與人類疾病相關的circRNA的信息[25]。雖然目前有許多關于circRNA的公共數(shù)據(jù)庫，極大的方便了研究人員之間的數(shù)據(jù)共享，但現(xiàn)有的數(shù)據(jù)庫仍然無法滿足研究人員的需要，希望后續(xù)有更多的關于circRNA以及其他非編碼RNA的公共數(shù)據(jù)庫可供人們使用。

圖1 circRNA的主要生物學功能

2 CircRNA在心血管疾病中的作用

2.1 CircRNA在高血壓中的作用 在發(fā)展中國家和發(fā)達國家，高血壓是最常見、最復雜的非傳染性疾病之一，目前全世界有近10億成年人患有高血壓。據(jù)預測，到2025年全球高血壓患病人數(shù)將增加5.6億[26]。高血壓可主要分為原發(fā)性高血壓(essential hypertension,EH)和繼發(fā)性高血壓兩種類型，其中以EH更為常見。Zheng等[27]基于基因芯片及實時定量聚合酶鏈反應(qRT-PCR)結(jié)果發(fā)現(xiàn)與健康對照相比，EH患者外周血中hsa-circRNA9102-5表達上調(diào)，且在體質(zhì)指數(shù)和高密度脂蛋白上存在明顯差異。同時通過生物信息學預測及qRT-PCR發(fā)現(xiàn)hsa-circRNA9102-5可充當hsa-miR-150-5p的分子海綿，參與EH的發(fā)生發(fā)展。另有研究表明，EH患者外周血hsa_circ_0037909的上調(diào)能夠促進EH，經(jīng)ROC曲線分析提示Hsa_circ_0037909可能通過影響血清肌酐或低密度脂蛋白從而導致EH的形成[28]。Liu等[29]研究表明EH患者中hsa_circ_0126991的過表達與EH的風險相關，并且可以作為EH早期診斷的穩(wěn)定生物標志物。以上研究揭示了circRNA在原發(fā)性高血壓發(fā)病機制中的重要作用，為高血壓的診治提供了新的研究方向。

2.2 CircRNA在MI中的作用 MI是由于冠狀動脈梗死導致心肌細胞持續(xù)性缺血缺氧引起心肌細胞壞死進而促發(fā)心肌細胞凋亡的過程。MI患者常常伴有心力衰竭、心律失常以及心肌纖維化等嚴重并發(fā)癥。Zhao等[30]研究發(fā)現(xiàn)，MI小鼠模型及低氧處理的原代心肌細胞中環(huán)狀RNA circMACF1表達下調(diào)，在小鼠體內(nèi)及體外原代心肌細胞中將circMACF1過表達后發(fā)現(xiàn)過表達的circMACF1可抑制心肌細胞凋亡進而改善心肌功能。緊接著利用熒光素酶報告基因等實驗發(fā)現(xiàn)，circMACF1可充當miR-500b-5p的分子海綿，通過競爭性的結(jié)合miR-500b-5p使其表達下降，進而引起其下游靶分子上皮膜蛋白1(EMP1)的表達增加，EMP1是一種轉(zhuǎn)錄相關的外周髓磷脂蛋白，它參與許多生理過程，例如細胞黏附和細胞間信號傳導。由此可知，circMACF1可通過miR-500b-5p/EMP1軸抑制小鼠心肌細胞的凋亡從而減輕MI。另有研究發(fā)現(xiàn)，circ-Ttc3在缺血性損傷的心肌細胞中表達上調(diào)，其在體內(nèi)能作為miR-15b的分子海綿起作用，通過circ-Ttc3-miR-15b-Arl2調(diào)節(jié)軸，對心肌細胞內(nèi)ATP耗竭和細胞凋亡起保護作用[31]。最新研究表明，circRNA還與心肌細胞的再生有關；MI小鼠模型中circCDYL表達下調(diào)，而將circCDYL過表達后能夠改善小鼠心臟功能，同時能夠促進體外心肌細胞的增殖[32]。circCDYL的這一作用機制是通過與miR-4793-5p形成分子海綿繼而抑制miR-4793-5p表達，導致下游靶基因APP表達增加，促進心肌細胞的增殖。

2.3 CircRNA在心肌纖維化中的作用 心肌纖維化是由于心肌成纖維細胞過度激活進而引起細胞外大量纖維蛋白沉積，導致心臟結(jié)構(gòu)破壞和功能降低，是一種常見的心臟病理改變。心肌纖維化的發(fā)病機制較為復雜，目前關于心肌纖維化的發(fā)病機制尚未完全闡明。Gu等[33]通過轉(zhuǎn)化生長因子β1刺激心肌成纖維細胞從而建立心肌纖維化的細胞模型，利用RNA測序技術(shù)檢測纖維化的心肌成纖維細胞中circRNA表達譜，發(fā)現(xiàn)總共有283個circRNA異常表達，其中79個circRNA表達上調(diào)，204個表達下調(diào)，并通過實時PCR驗證了相關circRNA。接下來作者基于差異表達的circRNA和生物信息學預測結(jié)果構(gòu)建了一個ceRNA網(wǎng)絡，對該ceRNA網(wǎng)絡進行模塊分析發(fā)現(xiàn)有3個模塊的基因與心肌纖維化的信號通路相關，包括“TGF-β信號通路”，“PI3K-Akt信號通路”，“AMPK信號通路”和“MAPK信號通路”，提示circRNA可能在心肌纖維化的發(fā)生發(fā)展中起調(diào)節(jié)作用。Ni等[34]研究發(fā)現(xiàn)在血管緊張素Ⅱ誘導后的心肌成纖維細胞和心臟組織中circHIPK3表達顯著增加，體外干擾circHIPK3表達后心肌成纖維細胞增殖、遷移得到有效抑制，同時在體內(nèi)將其沉默后，小鼠的心功能和心肌纖維化得到明顯改善。circHIPK3 的這一功能是通過使miR-29b-3p海綿化并上調(diào)a-SMA，COL1A1和COL3A1的表達來實現(xiàn)的。

CircRNA也參與了MI后心臟纖維化的發(fā)生。研究人員發(fā)現(xiàn)，用小干擾RNA干擾急性MI大鼠中circRNA 010567的表達后，MI大鼠的心功能有所改善，心肌纖維化有所減輕[35]。同時，Sun等[36]研究發(fā)現(xiàn)circ_LAS1L能夠抑制急性MI患者中心臟成纖維細胞的活化、增殖和遷移，并促進細胞凋亡，緊接著作者利用RNA免疫沉淀技術(shù)、RNA下拉和熒光素酶報告基因等證實circ_LAS1L可與miR-125b結(jié)合并抑制其活性，從而促進其下游靶基因分泌型卷曲相關蛋白5(Secreted Frizzled-related protein5,SFRP5)的表達，繼而抑制α-SMA、膠原纖維Ⅰ和膠原纖維Ⅲ的表達。表明circ_LAS1L可通過circ_LAS1L/miR-125b/SFRP5軸來調(diào)節(jié)心臟成纖維細胞的生物學功能，為MI后心肌纖維化的研究提供了重要理論依據(jù)。

2.4 CircRNA在心肌炎中的作用 心肌炎是指各種病因引起的心肌組織局限性或彌漫性炎癥病變，能導致患者心律不齊、心臟功能障礙甚至心源性休克。Zhang等[37]利用circRNA微陣列技術(shù)對3例暴發(fā)性心肌炎患兒和3例健康志愿者中circRNA的差異表達情況進行了分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)暴發(fā)性心肌炎病例中有3 173個circRNA與對照組相比差異表達(倍數(shù)變化>2，P<0.05)，其中2 282個上調(diào)，892個下調(diào)；通過qRT-PCR進行驗證發(fā)現(xiàn)hsa_circ_0071542上調(diào)了2.5倍，生物信息學預測發(fā)現(xiàn)hsa_circ_0071542可通過結(jié)合hsa-miR-8055 來調(diào)節(jié)MAPK的表達，MAPK在心肌炎的發(fā)展中具有重要作用，繼而推測circ_0071542可通過使miR-8055海綿化以控制MAPK表達，在暴發(fā)性心肌炎中發(fā)揮促炎作用。另有研究顯示，降低H9c2大鼠心肌細胞系中circANKRD36的表達后能夠使miR-138的表達上調(diào)，進而抑制了脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)激活的p38MAPK/NF-κB途徑，減輕LPS誘導的細胞凋亡和炎性損傷[38]。目前筆者發(fā)現(xiàn)關于circRNA在心肌炎中的研究較少，其相關作用有待進一步研究。

2.5 CircRNA在房顫中的作用 心房顫動是一種最常見的持續(xù)性心律失常，然而目前我們對circRNA在房顫發(fā)病機理中的作用仍知之甚少。最近，Zhang等[39]研究人員在心臟手術(shù)中采集人的心耳組織，分為房顫組和竇性心律組，通過高通量測序和生物信息學分析篩選出了147個差異表達的circRNA(102個上調(diào)和45個下調(diào))。隨后對這些circRNA所關聯(lián)的基因進行了GO(Gene Ontology)富集發(fā)現(xiàn)主要與病毒基因組復制和DNA復制起始的調(diào)控、蛋白質(zhì)結(jié)合等生物學過程相關，KEGG(Kyoto Encyclopediaof Genes and genome)通路分析結(jié)果顯示有19條通路可能與房顫的發(fā)展有關。另一項相關研究發(fā)現(xiàn)，在房顫患者和健康對照組中檢測到了23個在左右心耳中均差異表達的circRNA，其中20個上調(diào)和3個下調(diào)[40]。我們對這些circRNA靶標所涉及的途徑進行了基因集富集分析(GSEA)，發(fā)現(xiàn)circRNA hsa_circ_0000075和hsa_circ_0082096與TGF-β信號高度相關。已有研究表明TGF-β信號傳導途徑與房顫中的心房纖維化有關[41]，據(jù)此推測circRNA hsa_circ_0000075和hsa_circ_0082096可能通過TGF-β信號通路參與了房顫的發(fā)病機制。

2.6 CircRNA在血管內(nèi)皮細胞中的作用 已有研究證實circRNA在血管內(nèi)皮細胞功能障礙中也發(fā)揮了作用，繼而影響血管功能。一項研究采用微陣列技術(shù)在氧化型低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein，oxLDL)誘導的血管內(nèi)皮細胞中篩選了943個差異表達倍數(shù)大于2倍的circRNA，通過qRT-PCR驗證發(fā)現(xiàn)hsa_circ_0003575在oxLDL誘導的HUVEC中顯著上調(diào)，緊接著功能實驗表明將hsa_circ_0003575的表達沉默后，促進了內(nèi)皮細胞的增殖和血管生成能力[42]，但hsa_circ_0003575在內(nèi)皮細胞中發(fā)揮作用的具體機制有待進一步闡明。最近，Wang等[43]研究發(fā)現(xiàn)缺氧預處理的心肌細胞(CMs)所分泌的外泌體能夠轉(zhuǎn)移到心臟微血管內(nèi)皮細胞(cardiac microvascular endothelial cells，CMVECs)中并保護CMVECs免受氧化損傷，而這一保護作用正是通過外泌體中circHIPK3來實現(xiàn)的；機制研究表明circHIPK3可使CMVECs中的miR-29a大量海綿化，從而抑制了miR-29a對下游IGF-1的靶向作用，降低了CMVECs中活性氧(reactive oxygen species，ROS)水平及抑制CMVECs凋亡，即外泌體circHIPK3可通過miR-29a/IGF-1軸調(diào)節(jié)CMVECs中的氧化損傷。另有研究發(fā)現(xiàn)，高糖誘導的血管內(nèi)皮細胞功能障礙也有circRNA的參與：高糖誘導的人臍靜脈內(nèi)皮細胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cells，HUVECs)中hsa_circ_0054633異常高表達，將hsa_circ_0054633過表達后則減輕了HUVECs增殖和遷移，同時血管生成能力也有所恢復[44]。表明hsa_circ_0054633在高糖誘導的內(nèi)皮細胞功能障礙中具有一定的保護作用。

2.7 CircRNA在其他心血管疾病中的作用 Du等[45]研究發(fā)現(xiàn)circRNA-Foxo3在老年心臟病患者、老年小鼠以及H2O2處理的原代心肌細胞中表達上調(diào)；在Dox誘發(fā)的心肌病小鼠中，F(xiàn)oxo3的過表達會加劇模型小鼠心功能降低、心肌肥大和心肌纖維化，而抑制circRNA-Foxo3表達后則可對小鼠的心臟發(fā)揮保護作用。體外實驗表明，circ-Foxo3可與細胞質(zhì)中的衰老相關蛋白ID1和E2F1以及與壓力相關蛋白HIF1a和FAK結(jié)合，阻止了這些轉(zhuǎn)錄因子的核易位，從而促進心肌細胞衰老，加重小鼠的心功能損害。另有研究表明，糖尿病心肌病中也有circRNA的參與。環(huán)狀RNAhsa_circ_0076631可作為競爭性RNA與miR-214-3p結(jié)合，干擾hsa_circ_0076631的表達后，miR-214-3p表達升高，同時減少了高糖培養(yǎng)的心肌細胞中凋亡蛋白caspase-1的表達，從而減少了心肌細胞凋亡[46]。研究發(fā)現(xiàn)環(huán)狀RNAhsa_circ_0016070可通過miR-942/CCND1軸來促進肺動脈平滑肌細胞的增殖，繼而影響肺動脈高壓中的血管重塑，提示hsa_circ_0016070可能成為肺動脈高壓診斷和治療的新型生物標志物[47]。Zhou等[48]利用高通量測序技術(shù)分析了腹主動脈瘤患者中circRNA的表達譜，共得到411個差異表達的circRNA，其中包括145個上調(diào)和266個下調(diào)的circRNA。Yang等[49]發(fā)現(xiàn)在腹主動脈瘤小鼠模型中環(huán)狀RNA circCCDC66可通過使miR-342-3p海綿化來抑制血管平滑肌細胞的增殖和促進其凋亡，促進了腹主動脈瘤的發(fā)生發(fā)展。

本文主要介紹了circRNA在高血壓、MI、心臟纖維化、心肌炎等心血管疾病中的作用，對某些circRNA在心血管疾病中的調(diào)控作用以及分子機制做了梳理。在心肌炎方面，目前盡管circRNA與心肌炎的關系有了一些新發(fā)現(xiàn)，但仍處于起步階段，circRNA在心肌炎中的表達變化及其在心臟炎癥形成中的作用遠未闡明。我們發(fā)現(xiàn)，大部分circRNA都是作為miRNA的分子海綿而發(fā)揮生物學功能，circRNA通過直接與蛋白質(zhì)相互作用等其他作用方式來調(diào)控心血管疾病的研究較少，有待于學者進一步深入挖掘。相信不遠的將來circRNA的作用將不斷被明確，為心血管疾病的診斷和治療提供新的理論依據(jù)和治療策略。