CCR7與SELL在宮頸鱗狀細胞癌中的表達及臨床意義

安崇佑 趙奕暄 劉彩艷

宮頸癌是女性常見惡性腫瘤之一。宮旁侵犯及淋巴轉移是其主要轉移途徑，與治療、預后密切相關。早期宮頸癌(Ⅰ～Ⅱ期)治愈率可達80%，而Ⅲ期患者治愈率可達60%[1]。復發和轉移是宮頸癌主要的致死原因。隨著對人乳頭瘤病毒(human papillomaviruses,HPVs)與宮頸癌發病之間的關系的研究逐步深入，免疫微環境的改變在HPVs致宮頸癌的過程中具有舉足輕重的作用。因此，由于免疫發生是一個極為復雜的過程，故勢必有眾多免疫相關因子在各個環節扮演著不同的角色，找出其中起關鍵作用的因子理論上可以在早期阻斷、輔助治療及預防復發三個層面均起到至關重要的作用，實現早發現、早治療、早預防，或可進一步提高宮頸癌的治愈率。本研究應用UALCAN數據庫對相關性篩選功能，對TCGA中305例宮頸癌樣本進行篩選，篩選出對宮頸鱗狀細胞癌患者的預后具有顯著影響的潛在生物標志物。同時，對不同分期的宮頸鱗狀細胞癌患者的基因表達情況、CCR7和SELL基因共表達情況和生存曲線進行比較和分析，探索宮頸鱗狀細胞癌的潛在生物標志物，為宮頸惡性腫瘤的快速診斷和精準治療奠定堅實的基礎。

1 資料與方法

1.1 一般資料 用以分析SELL和CCR7表達關系的305例宮頸鱗癌患者數據均來自UALCAN平臺(http://ualcan.path.uab.edu)。UALCAN是一個基于互聯網的交互式網絡平臺，可以用于分析來源于TCGA的轉錄組和臨床數據。

1.2 方法 通過UALCAN在線工具可以得到腫瘤患者組織中基因的表達情況、共表達情況和生存分析等信息，包括箱線圖、基因熱圖和生存曲線[2]。

2 結果

2.1 CCR7和SELL 在宮頸鱗癌中的表達情況 宮頸癌患者組的CCR7和SELL基因的表達水平均高于正常對照組。同時，在不同分期的宮頸鱗狀細胞癌患者組中，CCR7和SELL的表達隨分期進展出現先升高后降低的過程，基因表達的高值出現在Stage2、Stage3兩個階段。其中SELL的表達在正常對照組和Stagel的比較，差異有統計學意義(P=0.026)，其余各組比較，差異無統計學意義(P>0.05)。見圖1，表1、2。

圖1 CCR7和SELL 在正常對照組和宮頸鱗癌患者組中的表達情況；a CCR7在正常對照組和宮頸鱗癌患者組中的表達情況；b SELL在正常對照組和宮頸鱗癌患者組中的表達情況；c CCR7在正常對照組和不同分期宮頸鱗癌患者組中的表達情況；d SELL在正常對照組和不同分期宮頸鱗癌患者組中的表達情況

表1 CCR7和SELL 在正常對照組和宮頸鱗癌患者組中的表達情況

表2 CCR7和SELL在正常對照組和不同分期宮頸鱗癌患者組中的表達情況

2.2 CCR7和SELL 在宮頸鱗癌中表達的相關性 顯示SELL與CCR7在宮頸鱗癌中的表達具有較強的正相關性(r=0.84)。SELL高表達的宮頸癌患者，其CCR7表達水平也相對較高，SELL 低表達患者，其CCR7的表達水平也較低。從CCR7和SELL 在宮頸鱗癌中表達相關性熱圖可以得知，CCR7和SELL位列彼此顯著相關的基因列表的第一和第二位，反映了這兩個基因之間緊密的共表達關系。這種基因之間的相關性在發揮生物學功能方面很可能存在密切的聯系。除了CCR7和SELL外，CD6、LY9、IL16、CD27和CD48等基因也存在著較為緊密的互作關系，但它們之間的相關程度低于CCR7和SELL。見圖2。

圖2 CCR7和SELL 在宮頸鱗癌中表達的相關性結果；a、b CCR7和SELL 在宮頸鱗癌中表達的相關性曲線；c、d CCR7和SELL 在宮頸鱗癌中表達相關性熱圖

2.3 CCR7和SELL表達水平與宮頸鱗癌患者預后的關系 CCR7和SELL表達水平與宮頸鱗癌患者生存曲線，從圖中可以看出，CCR7高表達組的生存情況優于低表達組，SELL高表達組的生存情況優于低表達組，差異均有統計學意義(P<0.01)。由此可見，CCR7和SELL高表達患者相較于低表達患者有更好的生存預期，反映了CCR7和SELL與宮頸鱗癌患者的生存有著潛在的聯系。見圖3。

圖3 CCR7和SELL表達水平與宮頸鱗癌患者生存曲線;a CCR7表達水平與宮頸鱗癌患者生存曲線；b SELL表達水平與宮頸鱗癌患者生存曲線

3 討論

宮頸癌作為婦科三大惡性腫瘤之一，仍嚴重威脅著無數女性生命。早期宮頸癌術后病理并不總是符合“理想情況”，一些特殊的病理表現仍提示著可能潛在的轉移可能，比如腫瘤大小、浸潤深度以及脈管內癌栓等，因此Sedlis標準應運而生。于是對于具有病理高風險的患者，追加放化療常作為補充治療以期達到降低復發、改善預后的目的。

UALCAN(http://ualcan.path.uab.edu/index.html)是一個生物信息學中常用的可以有效篩選和分析癌癥信息的平臺，主要是基于TCGA(The Cancer Genome Atlas)數據庫中的癌癥數據構建的，它可以幫助科研人員實現對相關基因的生物標志物鑒定、表達譜分析和生存分析等功能[3]。TCGA(The cancer genome atlas，癌癥基因組圖譜)由 National Cancer Institute(NCI，美國國家癌癥研究所)和 National Human Genome Research Institute(NHGRI，美國國家人類基因組研究所)于 2006 年聯合啟動的項目，收錄了各種人類癌癥(包括亞型在內的腫瘤)的臨床數據，基因組變異，mRNA表達，miRNA表達，甲基化等數據，是癌癥研究者很重要的數據來源。通過UALCAN平臺對TCGA數據的整合分析，研究人員可以獲得基因表達分析、共表達分析和生存分析等數據分析結果，提升了腫瘤生物學研究的工作效率和研究結果的可靠性。

SELL(L-selectin，CD62L)是Ⅰ型跨膜凝集素受體，是選擇素家族成員之一，表達于絕大多數循環白細胞表面的細胞黏附分子。SELL最著名的作用為誘導T細胞歸巢，并且通過多種通路發揮抗腫瘤作用，在多種惡生腫瘤動物模型中，CD62L+T細胞比CD62L-T細胞可以更高的控制腫瘤細胞的生長[4，5]。然而，最近H.Angharad Watson等人研究發現，L-Selectin控制實體腫瘤細胞生長并不是來自于對T細胞的歸巢作用，而是通過激活腫瘤內部的治療性T細胞實現的[5]。這一發現為研究SELL在惡性腫瘤中的作用提供了新的角度與思路。

CCR7(C-C chemokine receptor 7)屬于G蛋白偶聯受體家族，通常表達于T細胞亞組中央記憶細胞(T-cell subset central memory cell)、胸腺T細胞、B細胞和成熟樹突狀細胞。CCL21和CCL19成組型表達于淋巴管起始及淋巴結中，常出現于基質細胞和高內皮小靜脈。文獻顯示，CCL19和CCL21二者刺激CCR7可誘導G蛋白活性、EKR 1/2信號通路、鈣動員以及細胞移行[6]。CCR7/CCL21軸的過表達主要與腫瘤細胞淋巴結轉移有關[7]。同時，CCR7與包括多重惡性腫瘤進展相關，CCR7高表達往往意味著更大的腫瘤體積以及更深的組織侵犯。這一點與宮頸癌的臨床病理分期標準相契合。

然而，放化療的副反應、副損傷目前愈來愈受到重視，在生存率提高已達到瓶頸的今天，提高生存質量可以從另一方面為患者帶來的巨大收益。盡量避免不必要的放化療是提高生存治療的重要途徑之一。Sedlis不可否認在一定程度上解決了補充治療的問題，但此單純從局部病理結果推測患者潛在淋巴轉移風險仍存在一定不足。如果可以從循環系統中尋找可靠的生物標志物，多角度、多層次評估轉移、復發的風險，將能夠更加準確、可靠。

近年來，最新研究證實了通過檢測循環中SELL水平來發現腫瘤的可行性[8]。雖然SELL在宮頸癌中表達情況研究較少，但其在大腸癌、肝癌、肺癌等多種惡性腫瘤中表達的研究相對較成熟，武欣等[9]對大腸癌患者不同組織中SELL表達情況進行對比，發現大腸癌組織SELL表達明顯高于癌旁正常組織，同時，伴有淋巴轉移者SELL表達水平會進一步升高。在肺癌中同樣有類似的實驗結論[10]。而在婦科腫瘤中亦有人關注SELL的作用，相關研究證實了卵巢癌術前、術后以及術后復發、未復發患者血清中SELL水平的差異具有顯著性[11]，從而一定程度上證明了其在婦科惡性腫瘤中的潛在意義。

另一方面，CCR7在宮頸癌形成及淋巴轉移中也起著至關重要的作用。高危型人乳頭瘤病毒(human papillomaviruses,HPVs)感染是宮頸癌最主要的致病因素。隨著近年來研究逐漸深入，人們發現HPV感染的細胞會主動改變免疫微環境[12，13]，通過抑制樹突狀細胞CCR7的誘導作用，損害淋巴結歸巢趨化因子，進而影響到相應適應性免疫反應的發生。有研究發現，CCR7在伴有淋巴轉移的宮頸癌組織中呈現明顯高表達[14]。有研究也發現CCR7與腫瘤的淋巴細胞轉移密切相關[15]。本研究中發現，對于宮頸癌患者CCR7總體呈高表達，然而通過不同宮頸癌分期對實驗組分層比較后不難看出，CCR7表達在宮頸癌Ⅰ期和Ⅱ期呈明顯遞增趨勢，宮頸癌Ⅲ期患者則升高減緩甚至略有下降趨勢，而在Ⅳ期患者中則明顯下降。雖然宮頸癌被人為分成4個大的期別，然而宮頸癌發生發展的過程是連續的。最初自發的免疫增強作用和宮頸癌免疫抑制作用尚可相互制衡，但隨著疾病進展，此消彼長，最終實現免疫逃避。

同時，SELL的表達情況與CCR7類似，但不同的是SELL在Ⅳ期宮頸癌患者中仍有較高表達，甚至在宮頸癌Ⅰ～Ⅳ期中變化不是很大。這說明了二者作用途徑的差異。有學者提出SELL控制實體腫瘤細胞生長并不是來自于對T細胞的歸巢作用，而是通過激活腫瘤內部的殺傷性T細胞實現的[7]。這一觀點或許可以解釋本研究結果，宮頸癌以實體腫瘤為主，可激活的內部殺傷性T細胞理論上應與腫瘤體積呈正比，所以，宮頸癌惡化可能無法嚴重影響來自腫瘤內部的潛在殺傷力。這一假設仍需要進一步研究證實。因此，CCR7和SELL有望成為宮頸癌復發監測及預后評估的有效新指標，而且可能成為免疫治療的新靶點。

再者，CCR7和SELL在宮頸鱗癌患者組織樣本中表達上調在宮頸癌不同分期中差異的相似性，提示CCR7和SELL在存在一定的互作關聯，反映了機體對兩種基因在表達水平上的協同調節，與此相關的調控機制和通路值得進一步研究。除了分子水平的表達上調和基因互作，CCR7和SELL在機體表征方面也表現出對生存預期的影響，提示CCR7和SELL可能作為判斷宮頸鱗癌患者生存時間和生存質量等預后情況的重要標志物，這也印證了之前討論中的判斷。二者均具有臨床和科研應用價值。

最后，已有學者提出慢性炎癥會影響腫瘤的生長[16]。同時，免疫治療作為新的替換治療方案，在臨床上已經在多種惡性腫瘤的治療上已經取得了較明顯效果。免疫抑制劑單藥治療復發難治性宮頸癌具有較好的安全性，但總體緩解率仍偏低。SELL作為細胞黏附因子，可以誘導T細胞歸巢作用，并增強腫瘤細胞內的T細胞的殺傷作用，達到控制腫瘤細胞生長的目的[7]，而CCR7在腫瘤免疫微環境改變中起著至關重要的作用，對實現腫瘤進展的早期阻斷有重要意義。

綜上所述，本研究通過對UALCAN數據庫中對宮頸鱗狀細胞癌患者的預后具有顯著影響的基因的分析，篩選出對疾病的診斷和治療具有潛在價值的生物標志物。結果顯示，SELL和CCR7的高表達均能明顯改善宮頸癌患者生存率，因此，它們有可能成為控制宮頸癌發展、轉移的藥物治療的關鍵靶點，并為宮頸惡性腫瘤的防治提供新的思路和借鑒。