circCSPP1靶向miR-495-3p調控結直腸癌細胞的增殖和糖酵解

唐國偉 李華山 郭明浩 烏達美

結直腸癌是一種侵襲性的原發性腸道惡性腫瘤，其發病率、死亡率在全球各類癌癥中分別高居第三和第二位[1]。盡管早期篩查和根治性手術顯著提高了5年生存率，但大多數結直腸癌患者仍被診斷為晚期[2]。由于缺乏有效的治療手段，晚期患者死亡率較高。因此，尋找新的、有效的治療策略顯得至關重要。環狀RNA(circRNA)是一類由外顯子序列反向剪切產生的具有共價閉合環狀結構的內源性RNA，其通過與微小RNA(miRNA)反應元件結合負調控miRNA活性在腫瘤發生、進展中起關鍵作用[3,4]。研究顯示，circRNA中心體/紡錘體相關蛋白基因(circCSPP1)可促進人B細胞淋巴瘤和乳腺癌的進展[5,6]。在卵巢癌中，抑制circCSPP1表達可降低卵巢癌細胞的增殖、遷移和侵襲能力[7]。miRNA在腫瘤生物學進程中亦具有重要作用。研究顯示，miR-495-3p在結腸癌細胞中表達下調，過表達miR-495-3p抑制結直腸癌細胞的增殖、遷移和侵襲，促進細胞凋亡，發揮抑癌作用[8]。序列分析發現circCSPP1與miR-495-3p存在特異性結合位點。然而，circCSPP1在結腸癌中的作用及其生物學機制尚不清楚。有氧糖酵解是癌細胞的典型特征，抑制糖酵解有助于控制癌細胞的生長。本研究通過觀察在結腸癌組織中circCSPP1、miR-495-3p表達水平，重點探討circCSPP1對結腸癌細胞增殖和糖酵解的影響及其與miR-495-3p之間關系，以期為結直腸癌治療提供有效靶點。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 組織來源:收集2017年1月至2018年6月我院收治的結直腸癌患者41例，手術切除的癌組織及癌旁組織標本。患者術前均未行抗腫瘤治療。組織標本均在術后0.5 h內獲取，液氮保存備用。本研究在開展前已獲得我院倫理委員會批準，所有患者已簽署知情同意書。

1.1.2 細胞與試劑:人結直腸癌細胞HCT116購于中國典型培養物保藏中心；DMEM培養基、DMEM培養基購于美國Invitrogen公司；小干擾RNA(si-RNA)、miRNA模擬物(miRNA mimics)、miRNA抑制物(anti-miRNA)、雙熒光素酶報告載體由廣州復能基因公司提供；一步法RT-qPCR SuperMix試劑盒購于上海聯邁生物工程有限公司；TRIzol試劑、miRNeasy Mini試劑盒、PrimeScript RT試劑盒購于北京天根生化科技公司；細胞計數試劑盒(CCK-8)上海弗元生物科技有限公司；乳酸檢測試劑盒、葡萄糖檢測試劑盒購于北京索萊寶生化科技公司；放射免疫測定(RIPA)裂解緩沖液、兔抗人細胞周期素D1(CyclinD1)抗體、兔抗人p21抗體、兔抗人甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)抗體、山羊抗兔IgG二抗購于上海碧云天生物技術研究所。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養:HCT116細胞采用含有10%胎牛血清的DMEM培養基在37℃、含5% CO2的飽和濕度的培養箱中培養。

1.2.2 細胞轉染和實驗分組:將對數期HCT116細胞按照2×105/孔的密度接種到96孔板，細胞融合度為50%時更換為不含血清培養基，利用Lipofectamine 2000將si-NC、si-circCSPP1、miR-NC、miR-495-3p mimics、si-circCSPP1+anti-miR-NC、si-circCSPP1+anti-miR-495-3p分別轉染HCT116細胞，依次記為si-NC組、si-circCSPP1組、miR-NC組、miR-495-3p組、si-circCSPP1+anti-miR-NC組、si-circCSPP1+anti-miR-495-3p組，轉染6 h后更換為完全培養基，轉染48 h時收集細胞進行后續實驗。

1.2.3 實時熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測:分別使用TRIzol試劑、miRNeasy Mini試劑盒從組織、HCT116細胞中提取總RNA和miRNA。取5 μg總RNA與RNase R含量為3 U/μg的20 μl反應液孵育37℃孵育15 min，去除線性RNA。使用PrimeScript RT試劑盒將總RNA反轉錄為cDNA，利用一步法RT-qPCR SuperMix試劑盒進行RT-qPCR反應。2-ΔΔCt法計算circCSPP1、miR-495-3p相對表達量。Circ-CSPP1上游5’-AGCAACAGAGGAACAAGAG-3’，下游5’-GAGAAGGAACAGGATGAACT-3’；內參GAPDH上游5’-CGGAGTCAACGGATTTGGTCGTAT-3’，下游5’-AGCCTTCTCCATGGTGGTGAGAAC-3’；內參U6上游5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，下游5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。

1.2.4 細胞活力檢測:使用CCK-8試劑盒檢測細胞活力。將各轉染組HCT116細胞按照5×103/孔、100 μl/孔的密度接種96孔板，在24、48、72 h時間點取10 μl的CCK-8加至各孔中并孵育4 h。酶標儀檢測各孔在450 nm處吸光度(OD)值。

1.2.5 葡萄糖消耗和乳酸產生水平檢測:轉染48 h收集各組細胞培養液上清，分別按照乳酸檢測試劑盒、葡萄糖檢測試劑盒說明書操作檢測細胞培養基中的乳酸含量、葡萄糖消耗。

1.2.6 蛋白質印記(Western blot)分析:采用RIPA裂解緩沖液裂解6孔板各組細胞獲得上清液記為細胞總蛋白。蛋白定量后，用10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離等量蛋白質樣品，隨后利用濕電轉膜儀將已分離的細胞蛋白轉移至硝酸纖維素膜。含5%脫脂牛奶的封閉液37℃孵育膜2 h后，加入稀釋的兔抗人CyclinD1抗體、兔抗人p21抗體、兔抗人GAPDH抗體4℃孵育過夜，隨后用稀釋的山羊抗兔IgG二抗孵育膜2 h。加入化學發光底物顯影后，采用凝膠成像系統對目的蛋白表達進行定量分析。

1.2.7 雙熒光素酶報告基因實驗:將含有miR-495-3p結合位點的circCSPP1野生型或突變型序列克隆到熒光素酶報告質粒pGL3獲得雙熒光素酶報告載體WT-circCSPP1、MUT-circCSPP1。利用Lipofectamine 2000將miR-NC、miR-495-3p mimics分別與WT-circCSPP1、MUT-circCSPP1共轉染HCT116細胞，雙熒光素酶報告基因檢測系統測定轉染48 h后共轉染細胞中熒光素酶活性。將pcDNA、pcDNA-circCSPP1、si-NC、si-circCSPP1分別轉染HCT116細胞，RT-qPCR檢測轉染48 h后細胞中miR-495-3p表達水平。

2 結果

2.1 circCSPP1和miR-495-3p在結直腸癌組織中的表達 與癌旁組織比較，結直腸癌組織中circCSPP1表達顯著升高，miR-495-3p表達顯著降低(P<0.05)。見表1。

表1 circCSPP1和miR-495-3p在結直腸癌組織中的表達

2.2 抑制circCSPP1表達對結直腸癌HCT116細胞增殖和糖酵解的影響 與si-NC組比較，si-circCSPP1組HCT116細胞circCSPP1表達顯著降低，細胞活力、CyclinD1蛋白表達顯著降低，p21蛋白表達顯著升高，葡糖糖消耗和乳酸產生水平顯著降低，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖1，表2。

圖1 增殖相關蛋白表達

表2 抑制circCSPP1表達對結直腸癌HCT116細胞增殖和糖酵解的影響

2.3 過表達miR-495-3p對結直腸癌HCT116細胞增殖和糖酵解的影響 與miR-NC組比較，miR-495-3p組HCT116細胞miR-495-3p表達顯著升高，細胞活力、CyclinD1蛋白表達顯著降低，p21蛋白表達顯著升高，葡糖糖消耗和乳酸產生水平顯著降低，差異有統計學意義(P<0.05)。見表3，圖2。

表3 miR-495-3p過表達對結直腸癌HCT116細胞增殖和糖酵解的影響

圖2 增殖相關蛋白表達

2.4 circCSPP1靶向調控miR-495-3p的表達 StarBase數據庫在線分析結果顯示，circCSPP1與miR-495-3p存在互補結合位點。miR-495-3p和WT-circCSPP1共轉染組HCT116細胞的熒光素酶活性較miR-NC和WT-circCSPP1共轉染組顯著降低(P<0.05)；miR-495-3p和MUT-circCSPP1共轉染組HCT116細胞的熒光素酶活性與miR-NC和MUT-circCSPP1共轉染組比較差異無統計學意義(P>0.05)。RT-qPCR檢測顯示，pcDNA-circCSPP1組HCT116細胞miR-495-3p的表達水平較pcDNA組顯著降低(P<0.05)；si-circCSPP1組HCT116細胞miR-495-3p的表達水平較si-NC組顯著升高(P<0.05)。見圖3，表4、5。

圖3 circCSPP1的序列中含有與miR-495-3p互補的核苷酸序列

表4 雙熒光素酶報告實驗

表5 circCSPP1調控miR-495-3p的表達

2.5 干擾miR-495-3p表達逆轉抑制circCSPP1表達對結直腸癌HCT116細胞增殖和糖酵解的作用 與si-circCSPP1+anti-miR-NC組比較，si-circCSPP1+anti-miR-495-3p組HCT116細胞miR-495-3p的表達水平顯著降低，細胞活力、CyclinD1蛋白表達顯著升高，p21蛋白表達顯著降低，葡糖糖消耗和乳酸產生水平顯著升高(P<0.05)。見圖4，表6。

圖4 增殖相關蛋白表達

表6 干擾miR-495-3p表達逆轉抑制circCSPP1表達對結直腸癌HCT116細胞增殖和糖酵解的作用

3 討論

CSPP1最初被證實與G1/S期進程和紡錘體裝配中發揮作用。circCSPP1是由CSPP1反向剪切形成的circRNA，其通過調控細胞增殖、遷移侵襲和凋亡，在腫瘤進程具有重要功能。肝癌中circCSPP1表達上調，circCSPP1表達水平與肝癌腫瘤大小、臨床病例分期以及不良預后有關，circ-CSPP1高表達促進肝癌細胞的體外活力、集落形成、遷移和侵襲能力，是肝癌患者潛在預后和治療標志物[9]。宮頸癌中，抑制circCSPP1表達可抑制癌細胞的增殖和遷移，抑制腫瘤生長[10]。此外，抑制circCSPP1表達還可抑制膠質瘤和卵巢癌細胞的上皮間充質轉化，降低細胞遷移和侵襲能力[11]。本研究顯示結腸癌組織中circCSPP1表達顯著上調。轉染特異性si-circCSPP1抑制circCSPP1表達可降低HCT116細胞的增殖能力、降低CyclinD1表達水平，升高p21表達水平。CyclinD1和p21是細胞周期進程中的重要調控蛋白，CyclinD1結合并激活細胞周期蛋白激酶(CDKs)觸發Rb磷酸化使細胞周期向S期推進發揮增殖促進作用，而p21抑制CyclinD1/CDKs復合物活性發揮抗增殖作用[12]。即使在常氧條件下癌細胞依然會消耗葡萄糖產生乳酸進行糖酵解，這是癌細胞的重要代謝特征[13]。糖酵解除提供能量外，還可產生代謝中間體促進生物合成代謝提高腫瘤細胞在酸性腫瘤微環境中的生存優勢，進而維持其干細胞特性并促進腫瘤免疫逃逸[14]。本研究顯示，抑制circCSPP1表達可降低葡萄糖消耗量和乳酸產生量，抑制糖酵解。因此，抑制circCSPP1可降低結直腸癌細胞的增殖能力，抑制糖酵解反應。

研究顯示，Hsa_circRNA_103809通過負調控miR-532-3p表達抑制結直腸癌細胞的增殖和遷移[15]。通過上調miR-597-5p表達可降低結直腸癌細胞的DNA修復能力，抑制細胞增殖，誘導細胞凋亡[16]。本研究通過生物信息學分析預測發現circCSPP1與miR-495-3p存在相互作用。已有研究表明，miR-495-3p在胃癌、黑色素瘤、透明腎細胞癌具有抑癌作用，過表達miR-495-3p能夠降低癌細胞的增殖、遷移和侵襲能力[17-19]。本研究顯示結腸癌組織中miR-495-3p表達顯著降低，過表達miR-495-3p可抑制HCT116細胞增殖和糖酵解反應，與抑制circCSPP1表達的抗腫瘤作用一致。進一步雙熒光素酶報告實驗和RT-qPCR檢測證實circCSPP1靶向負調控miR-495-3p表達。此外，抑制miR-495-3p表達能夠挽救circCSPP1低表達對HCT116細胞增殖和糖酵解的抑制作用。基于上述結果，本研究推斷circCSPP1靶向miR-495-3p參與調控結直腸癌細胞的增殖和糖酵解反應。

綜上所述，circCSPP1在結直腸癌中呈高表達，抑制circCSPP1可降低結直腸癌細胞的增殖能力，抑制糖酵解反應，其機制與靶向調控miR-495-3p表達有關，因此circCSPP1有望成為結直腸癌治療的潛在靶點。