GLP-2基于PI3K/AKT信號通路對急性胰腺炎模型的干預作用研究

康曉芳

急性胰腺炎在臨床中屬于一種常見的消化道疾病，有10%～15%的急性胰腺炎患者會發(fā)展成為重癥胰腺炎，胰腺組織發(fā)生缺血壞死，全身多種器官發(fā)生損傷，嚴重的會導致患者死亡[1]。van Dijk等[2]研究指出，急性胰腺炎在臨床中病情不容易控制，患者具有較高的死亡率，并且大部分患者在發(fā)病后常常引起全身炎性反應(yīng)，引起多器官功能衰竭，加重患者病情惡化。有研究證實，部分急性胰腺炎患者出現(xiàn)腸道損傷癥狀，嚴重影響患者的生存質(zhì)量[3]。經(jīng)過TUNEL染色結(jié)果顯示，急性胰腺炎模型大鼠胰腺細胞明顯凋亡，PI3K/AKT信號通路在其凋亡過程中發(fā)揮著關(guān)鍵性的作用[4]。胰高血糖素樣肽-2(GLP-2)屬于一種胰高血糖素原衍生肽中的重要生長因子，對腸道有直接的作用，促進腸道組織生長。隨著研究的不斷深入發(fā)現(xiàn)，GLP-2在腸道黏膜增殖、修復過程中發(fā)揮著重要作用[5]。本文旨在研究GLP-2基于對PI3K/AKT信號通路對急性胰腺炎模型的干預作用，為其在臨床應(yīng)用提供數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 研究動物 選取30只Wistar雄性大鼠，體重為160～220 g，均由華阜康生物科技股份有限公司提供[動物生產(chǎn)許可證號：SCXK：(京)2019-0017]。大鼠均進行單籠飼養(yǎng)，自由飲水、進食，室溫18～25℃。

1.2 方法

1.2.1 急性胰腺炎模型建立及分組干預:30只大鼠中選取10只為正常組，其余20只參考劉璐璐等[6]文獻建立急性胰腺炎模型。具體操作：將大鼠脫毛后使用0.3 ml/kg水合氯醛給予腹腔麻醉，固定于操作臺中，將大鼠開腹后選擇磨平針頭1 ml注射器十二指腸乳頭開口處緩緩進入胰膽管處，注入1 ml/kg 3.5%牛黃膽酸鈉溶液注入其中，推注速度為0.2 ml/min。觀察大鼠胰腺組織，一旦發(fā)現(xiàn)組織腫脹、充血，說明模型建立成功，之后將顯微動脈夾去除，針頭拔出，逐層關(guān)腹腔，急性胰腺炎模型大鼠術(shù)后禁食，自由飲水。成功18只，隨機分為模型組和GLP-2試劑組，每組9只，等到大鼠麻醉蘇醒后，GLP-2試劑組給予0.25 mg/kg GLP-2試劑給予腹腔注射，正常組、模型組大鼠干預采用無菌0.9%氯化鈉溶液完成。每組大鼠持續(xù)干預3 d。

1.2.2 檢測血清淀粉酶、脂肪酶、DAO、D-乳酸、白細胞計數(shù)、CRP、TNF-α水平:抽取3組大鼠腹部靜脈血3 ml，以3 000 r/min離心速度，離心處理10 min后，分離上層血清，在-80℃環(huán)境中保存，待檢。采用酶聯(lián)免疫吸附法：將提前稀釋好的標準品100 μl加入相應(yīng)的微孔板反應(yīng)空中，第1孔只加樣品稀釋液為零孔。蓋上模板混合均勻，在37℃下處理90 min，甩去孔內(nèi)液體，吸干水分；將準備好的抗體加入到每孔中0.1 ml，在37℃下處理60 min，底物四甲基聯(lián)苯胺(TMS)空白孔不加；甩去孔內(nèi)液體，每孔中加滿0.01 mmol/L PBS，浸泡1～2 min，甩去孔內(nèi)液體，吸干水分；每孔中加入90 μl TMS，避光處理15～20 min；每孔中加入90 μl TMS終止液，即藍色變?yōu)辄S色。在波長450 mm處分析Cleave淀粉酶、脂肪酶、DAO、D-乳酸、CRP、TNF-α水平。采用全自動血細胞分析儀檢測3組大鼠白細胞計數(shù)。

1.2.3 統(tǒng)計胰腺干濕重比、病理學觀察及胰腺病理評分:采用戊巴比妥鈉注射法安樂死劑量為200 mg/kg，解剖大鼠，提取大鼠胰腺組織，使用天平稱取重量后將其置于60℃恒溫箱中連續(xù)干燥48 h，再次稱取重量，胰腺干濕比重=干燥前胰腺質(zhì)量/干燥后胰腺質(zhì)量。從水腫、炎癥、出血、壞死4個方面進行評分，每個方面的評分分為5個級別，0～4分，評分越高說明患者病情越重。快速解剖并提取大鼠胰腺組織制作標本，將其置于4%的多聚甲醛中進行固定，制作常規(guī)石蠟切片，蘇木精-伊紅染色10 min后，沖洗乙醇梯度脫水后，封片。

1.2.4 檢測PI3K、Akt、p-Akt蛋白表達:采用Western Blot檢測，將采集到的血液標本10 000×g離心處理10 min，對上清液進行提取后，BCA進行蛋白定量檢測，在2×SDS凝膠緩沖液中加入50 μg蛋白，在100℃環(huán)境中加熱5 min有助于蛋白發(fā)生變性。凝膠電泳完、轉(zhuǎn)膜，取膜，4℃環(huán)境下在5%脫脂牛奶中固定、封閉處理時間為1 h，將一抗使用0.05%～0.1% TBST給予稀釋(PI3K、Akt、p-Akt一抗為1∶1 000)，4℃孵育過夜保存，之后使用0.05%～0.1% TBST洗膜，3次，每次為5 min，二抗被0.05%～0.1% TBST稀釋(1∶10 000)，搖動孵育時間為1 h，再次采用TBST連續(xù)洗膜3次，處理時間為5 min。DAB顯色，定量分析蛋白表達情況。以GAPDH為內(nèi)參。

2 結(jié)果

2.1 3組大鼠血清淀粉酶、脂肪酶、DAO、D-乳酸水平比較 與正常組相比，模型組和GLP-2試劑組血清淀粉酶、脂肪酶、DAO、D-乳酸水平升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與模型組相比，GLP-2試劑組血清淀粉酶、脂肪酶、DAO、D-乳酸水平降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 3組大鼠血清淀粉酶、脂肪酶、DAO、D-乳酸水平比較

2.2 3組大鼠白細胞計數(shù)、CRP、TNF-α水平比較 與正常組相比，模型組和GLP-2試劑組白細胞計數(shù)、CRP、TNF-α水平升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與模型組相比，GLP-2試劑組白細胞計數(shù)、CRP、TNF-α水平降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 3組大鼠白細胞計數(shù)、CRP、TNF-α水平比較

2.3 3組大鼠胰腺干濕重比、胰腺病理評分比較 與正常組相比，模型組和GLP-2試劑組胰腺干濕重比、胰腺病理評分升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與模型組相比，GLP-2試劑組胰腺干濕重比、胰腺病理評分降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 3組大鼠胰腺干濕重比、胰腺病理評分比較

2.4 3組大鼠胰腺病理組織觀察 正常組胰腺組織細胞大小均勻，細胞排列整齊，細胞未見腫脹、充血，無炎性細胞浸潤。模型組胰腺組織表現(xiàn)腫脹，血管表現(xiàn)為明顯的擴張充血，毛細血管有不同程度壞死灶，伴有大量炎性細胞浸潤。GLP-2試劑組胰腺組織腺泡細胞壞死灶明顯減少，但仍存在間質(zhì)性水腫。見圖1。

正常組 模型組 GLP-2試劑組

2.5 3組大鼠PI3K、Akt、p-Akt蛋白表達比較 與正常組相比，模型組和GLP-2試劑組PI3K、Akt、p-Akt蛋白表達降低；與模型組相比，GLP-2試劑組PI3K、Akt、p-Akt蛋白表達升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表4，圖2。

模型組 GLP-2試劑組 正常組

表4 3組大鼠PI3K、Akt、p-Akt蛋白表達比較

3 討論

目前臨床中關(guān)于急性胰腺炎發(fā)病機制上不完全明確，受多種因素的影響，其發(fā)病后產(chǎn)生的不良反應(yīng)與機體胰腺中胰酶活性有關(guān)，一旦其被激活，或?qū)е卵仔苑磻?yīng)發(fā)生，機體中出現(xiàn)炎癥失衡[7,8]。因此尋找其相關(guān)方機制對患者來說至關(guān)重要。GLP-2作為一種活性物質(zhì)，屬于一種腸道特異性受體，參與機體胃腸道反應(yīng)，對小腸黏膜細胞生長有明顯的促進作用，并且能調(diào)控細胞凋亡，參與腸道發(fā)育過程[9,10]。

淀粉酶是臨床中用于胰腺炎診斷的主要指標，在重癥急性胰腺炎患者中，淀粉酶在6～12 h內(nèi)會明顯升高，其中24 h到達峰值，等到48 h后逐漸降低，在3～5 d后會恢復到正常水平[11]。在急性胰腺炎發(fā)病時，胰酶激活后，會破壞胰腺細胞，胰腺自身消化[12]。乳酸主要是通過腸道中的微生物大量產(chǎn)生，當腸黏膜受損，乳酸會通過受損的黏膜屏障進入到血液中[13]。謝齊貴等[14]研究指出，乳酸能有效的反應(yīng)機體腸黏膜損傷情況。DAO因其活性較高，能保護機體腸黏膜不被損傷。急性胰腺炎發(fā)生時容易導致腸黏膜細胞發(fā)生缺血缺氧，細胞破裂，大量DAO被釋出，因此血液中DAO水平較高[15]。本研究中GLP-2試劑能明顯降低急性胰腺炎模型大鼠血清淀粉酶、脂肪酶、DAO、D-乳酸水平，從而改善模型腸道黏膜損傷狀況，促進腸道功能恢復。

白細胞大量被激活，會導致大量炎性因子被釋放，機體引發(fā)炎性反應(yīng)。相關(guān)研究顯示，當機體處于炎性反應(yīng)過程中，會導致大量炎性介質(zhì)釋放到機體血液中，從而導致全身炎性反應(yīng)發(fā)生[16]。也有研究指出，一旦臟器組織發(fā)生嚴重的炎性反應(yīng)，會導致臟器促炎因子、抗炎介質(zhì)失衡[17]。CRP、TNF-α是機體中常見的炎性細胞因子，一旦進入到人體血管中，會隨著血流方向向人體擴散，引發(fā)炎性反應(yīng)，產(chǎn)生嚴重損傷會加重急性胰腺炎病情[18]。急性胰腺炎引發(fā)腸道炎癥，與機體中炎性細胞激活、聚集、浸潤有關(guān)，導致大量炎癥介質(zhì)產(chǎn)生，局部微循環(huán)發(fā)生改變[19]。GLP-2試劑能降低急性胰腺炎模型大鼠白細胞計數(shù)、CRP、TNF-α水平，從而抑制炎性反應(yīng)，控制疾病發(fā)展。

急性胰腺炎發(fā)生時，胰腺組織會誘導炎性滲出，出現(xiàn)腸麻痹，大量液體被丟失后，機體發(fā)生應(yīng)激反應(yīng)，總血容量嚴重缺乏，為了維持重要臟器血供，小腸強烈收縮血管。腸黏膜一旦發(fā)生缺血、缺氧，會降低細胞內(nèi)產(chǎn)能，損傷腸黏膜，大量炎性細胞因子滲入到血液中，杯狀細胞數(shù)量大量減少，導致患者小腸頂端上皮細胞發(fā)生壞死、脫落等，最終潰瘍產(chǎn)生[20]。本研究結(jié)果證實，GLP-2試劑能改善急性胰腺炎模型胰腺組織結(jié)構(gòu)，從而改善大鼠表現(xiàn)癥狀。PI3K/AKT信號通路屬于一種典型的抗凋亡通路，PI3K是磷脂激酶家族重要因子，能特異性催化磷脂酰肌醇脂類，在細胞內(nèi)分子生物信號轉(zhuǎn)變過程中發(fā)揮著重要作用，PI3K能調(diào)節(jié)AKT功能，一旦AKT被磷酸化激活，對下游蛋白也有一定的激活能力，參與多種生物學過程[21,22]。本研究結(jié)果中，GLP-2試劑能激活PI3K、Akt、p-Akt蛋白表達，從而進一步激活PI3K/AKT信號通路，急性胰腺炎模型干預效果顯著。

綜上所述，GLP-2試劑通過調(diào)控PI3K/AKT信號通路相關(guān)蛋白，對急性胰腺炎模型干預效果顯著，能改善模型胰腺組織以及腸道黏膜損傷狀況，抑制機體炎性反應(yīng)，為其在臨床應(yīng)用提供數(shù)據(jù)參考。