七氟醚調控卵巢癌細胞的增殖、遷移、侵襲和凋亡的機制

黎皆佳 謝海輝 杜笑興

研究表明，麻醉劑、麻醉技術和其他圍術期因素是影響惡性腫瘤手術后長期轉歸的潛在因素，麻醉藥物與腫瘤患者術后轉移復發有關[1,2]。七氟醚是一種常用吸入麻醉藥，近年來發現其與腫瘤的惡性生物學行為有關，對不同癌細胞生長和凋亡的影響不同[3]。研究報道七氟醚可促進人膠質母細胞瘤細胞的遷移，侵襲和集落形成能力[4]。而有研究報道七氟醚呈濃度依賴性抑制肺癌A549細胞侵襲和遷移[5]。七氟醚通過上調miR-203抑制乳腺癌細胞增殖[6]。七氟醚通過下調斯坦尼鈣調節蛋白1(stanniocalcin 1，STC1)抑制卵巢癌細胞的生長和侵襲[7]。七氟醚通過調節c-Jun NH2-末端激酶(c-Jun NH2-terminal kinase，JNK)和p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinases，p38 MAPK)信號通路抑制人卵巢癌細胞的增殖和侵襲，促進細胞凋亡[8]。研究表明，miR-143-3p在卵巢癌組織中表達水平降低；miR-143-3p上調顯著抑制了卵巢癌細胞系SKOV3，ES2和OVCAR3的增殖，遷移和侵襲[9]。轉化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)1通過調控miR-143-3p/胱抑素B(cystatin B，CSTB)影響卵巢癌細胞的增殖和凋亡[10]。然而七氟醚是否通過調控miR-143-3p影響卵巢癌細胞的增殖、遷移侵襲和凋亡筆者目前尚未發現明確結論。本實驗旨在研究七氟醚是否通過調控miR-143-3p影響卵巢癌細胞的增殖、遷移侵襲和凋亡，結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 組織來源 選取本院2017年1月至2019年1月經病理檢測為卵巢癌且具有完整臨床病理資料的患者30例，經手術切除癌組織及其癌旁組織，患者手術前未進行過手術及放化療，距離癌組織邊緣2～5 cm 處切除的為癌旁組織，所有患者均知情且同意。

1.2 試劑 卵巢癌細胞株SKOV3購自上海酶研生物科技有限公司；胎牛血清、RPMI-1640培養基購自美國Gibco公司；七氟醚購自上海江萊生物科技有限公司；Trizol試劑、RT-qPCR試劑盒購自北京麥瑞博生物科技有限公司；MTT試劑盒、Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒購自上海圻明生物科技有限公司；Transwell小室、Matrigel購自美國BD公司；RIPA蛋白裂解液、二辛可寧酸(bicinchoninic acid，BCA)試劑盒購自上海研生實業有限公司；抗體購自上海恒斐生物科技有限公司。

1.3 細胞處理與分組 卵巢癌細胞SKOV3培養于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養基中，取對數生長期細胞，分別用1%、1.5%、2%的七氟醚處理24 h，記為不同濃度七氟醚組；正常培養的細胞作為對照組；miR-NC、miR-143-3p轉染至SKOV3細胞中，記為miR-NC組、miR-143-3p組；anti-miR-NC、anti-miR-143-3p轉染至SKOV3細胞后用2%的七氟醚處理，記為2%七氟醚+anti-miR-NC組、2%七氟醚+anti-miR-143-3p組。

1.4 實時熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測miR-143-3p表達 各組細胞培養48 h后提取細胞總RNA，合成cDNA，以U6為內參進行PCR擴增，相對表達量采用2-ΔΔCt法計算。miR-143-3p上游引物序列：5’-GGGGTGAGATGAAGCACTG-3’，下游引物序列：5’-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3’；U6上游引物序列：5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，下游引物序列：5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。

1.5 MTT檢測細胞活性 細胞培養24 h，每孔加入20 μl的MTT溶液，孵育4 h，每孔加入150 μl DMSO，振蕩反應10 min使沉淀溶解，用酶標儀于波長490 nm處檢測吸光度(OD)值。

1.6 Transwell檢測細胞遷移和侵襲 細胞遷移實驗：將細胞調整密度為5×105個/ml，上室加入100 μl懸浮液，下室加入600 μl培養液，培養24 h，4%多聚甲醛固定30 min，PBS溶液沖洗2次，0.1%結晶紫染色30 min，用PBS輕輕清洗兩次后，然后用倒置顯微鏡拍攝染色細胞的照片，計算細胞遷移數。細胞侵襲實驗：Transwell小室的上室加入適量基質膠，按上述方法操作，計算細胞侵襲數。

1.7 流式細胞術檢測細胞凋亡 各組細胞培養24 h，用預冷的PBS漂洗2次，用結合緩沖液重懸，加入10 μl 的Annexin V-FITC和5 μl的PI，混勻后避光孵育10 min；用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.8 蛋白質印跡(Western blot)法檢測蛋白表達 收集細胞，提取總蛋白，定量后煮沸變性；電泳后轉至聚偏二氟乙烯膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，再加入一抗4℃孵育過夜；加入二抗室溫孵育2 h，ECL發光液顯影，成像后檢測蛋白條帶的灰度值，蛋白相對表達水平=目的條帶灰度值/GAPDH條帶灰度值。

2 結果

2.1 miR-143-3p在卵巢癌組織中的表達 與癌旁組織比較，卵巢癌組織中miR-143-3p表達水平降低(P<0.05)。見表1。

表1 miR-143-3p在卵巢癌組織中的表達

2.2 七氟醚對卵巢癌SKOV3細胞增殖、遷移侵襲和凋亡的影響 與對照組比較，1%、1.5%、2%七氟醚組細胞活性降低，細胞遷移、侵襲數降低，細胞凋亡率升高，CyclinD1、MMP-2、MMP-9、Bcl-2表達水平降低，p21、Bax表達水平升高，且呈劑量依賴性(P<0.05)。見表2、3，圖1、2。

表2 七氟醚對卵巢癌SKOV3細胞增殖、遷移侵襲和凋亡的影響

表3 七氟醚對卵巢癌SKOV3細胞增殖、遷移侵襲和凋亡相關蛋白的影響

圖1 七氟醚對卵巢癌SKOV3細胞遷移侵襲和凋亡的影響/A 卵巢癌SKOV3細胞的遷移侵襲(結晶紫染色×200)；B 細胞凋亡流式圖

圖2 增殖、遷移侵襲和凋亡相關蛋白的表達

2.3 七氟醚對卵巢癌SKOV3細胞中miR-143-3p的影響 與對照組相比，1%、1.5%、2%七氟醚組miR-143-3p升高，且呈劑量依賴性(P<0.05)。見表4。

表4 七氟醚對卵巢癌SKOV3細胞中miR-143-3p的影響

2.4 上調miR-143-3p對卵巢癌SKOV3細胞增殖、遷移侵襲和凋亡的影響 與miR-NC組比較，miR-143-3p組miR-143-3p表達水平升高，細胞活性降低，細胞遷移、侵襲數降低，細胞凋亡率升高，CyclinD1、MMP-2、MMP-9、Bcl-2表達水平降低，p21、Bax表達水平升高(P<0.05)。見表5、6，圖3、4。

表5 上調miR-143-3p對卵巢癌SKOV3細胞增殖、遷移侵襲和凋亡的影響

表6 上調miR-143-3p對卵巢癌SKOV3細胞增殖、遷移侵襲和凋亡相關蛋白的影響

圖3 上調miR-143-3p對卵巢癌SKOV3細胞遷移侵襲和凋亡的影響;A 卵巢癌SKOV3細胞的遷移侵襲(結晶紫染色×200)；B 細胞凋亡流式圖

2.5 下調miR-143-3p逆轉了七氟醚對卵巢癌SKOV3細胞增殖、遷移侵襲和凋亡的影響 與2%七氟醚+anti-miR-NC組比較，2%七氟醚+anti-miR-143-3p組細胞活性升高，細胞遷移、侵襲數升高，細胞凋亡率降低，CyclinD1、MMP-2、MMP-9、Bcl-2表達水平升高，p21、Bax表達水平降低(P<0.05)。見表7、8，圖5。

圖4 增殖、遷移侵襲和凋亡相關蛋白的表達

圖5 下調miR-143-3p逆轉了七氟醚對卵巢癌SKOV3細胞遷移侵襲和凋亡的影響;A 卵巢癌SKOV3細胞的遷移侵襲(結晶紫染色×200)；B 細胞凋亡流式圖

表7 下調miR-143-3p逆轉了七氟醚對卵巢癌SKOV3細胞增殖、遷移侵襲和凋亡的影響

表8 下調miR-143-3p逆轉了七氟醚對卵巢癌SKOV3細胞增殖、遷移侵襲和凋亡相關蛋白的影響

3 討論

研究發現麻醉藥可影響卵巢癌的惡性生物學行為[11,12]。麻醉藥物或麻醉方法影響腫瘤患者預后及轉歸[13]。研究報道七氟烷可降低細胞中MMP-2、MMP-9表達水平，抑制乳腺癌細胞遷移和侵襲[14,15]。七氟醚可通過上調miR-203或miR-34a抑制結直腸癌細胞的遷移和侵襲[16,17]。七氟醚通過在體外激活缺氧誘導因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α)信號傳導通路來抑制頭頸部鱗狀細胞癌的惡性生物學行為[18]。且已有研究報道七氟醚可抑制卵巢癌細胞增殖和侵襲，促進細胞凋亡[8]。本實驗結果顯示，不同濃度七氟醚后的SKOV3細胞中，細胞活性降低，細胞遷移、侵襲數降低，細胞凋亡率升高，CyclinD1、MMP-2、MMP-9、Bcl-2表達水平降低，p21、Bax表達水平升高，且呈劑量依賴性。表明七氟醚可劑量依賴性的抑制卵巢癌細胞SKOV3增殖、遷移和侵襲，并促進細胞凋亡。

研究報道上調miR-143-3p通過下調RalA結合蛋白1(RalA-binding protein 1，RALBP1)表達抑制卵巢癌細胞增殖，促進細胞凋亡[19]。miR-143-3p還通過靶向FOS樣抗原2(Fos-like antigen 2，FOSL2)抑制骨肉瘤的增殖，遷移和侵襲[20]。miR-143-3p的上調通過靶向Musashi RNA結合蛋白2(Musashi RNA binding protein 2，MSI2)誘導細胞凋亡并抑制乳頭狀甲狀腺癌細胞的增殖，侵襲和遷移[21]。本實驗結果顯示，與癌旁組織比較，卵巢癌組織中miR-143-3p表達水平降低；上調miR-143-3p抑制了卵巢癌細胞SKOV3增殖、遷移和侵襲，且促進了細胞凋亡。此外，本實驗發現不同濃度七氟醚后的SKOV3細胞中，miR-143-3p表達水平升高；而下調miR-143-3p逆轉了七氟醚對卵巢癌SKOV3細胞增殖、遷移、侵襲和凋亡的影響。提示，七氟醚可能通過影響miR-143-3p的表達調控卵巢癌SKOV3細胞增殖、遷移、侵襲和凋亡。

綜上所述，七氟醚可通過上調miR-143-3p的表達抑制卵巢癌細胞增殖、遷移侵襲，并促進細胞凋亡。