超聲輔助離子液體提取葡萄籽中蛋白質的方法研究

●劉彥峰 李 霞

（1.甘肅莫高實業發展股份有限公司 甘肅 武威 733008；2.甘肅畜牧工程職業技術學院 甘肅 武威 733008）

葡萄是世界上種植最廣泛的水果之一，全世界年產量超過690億千克［1］，果實可釀酒。釀制葡萄酒的主要副產品是葡萄渣，占葡萄總重量的13%，其中含有38%～52%（以干物質計）的葡萄籽。有研究發現，葡萄籽蛋白質提取物可作為一種有價值的葡萄酒澄清劑［2］。但大多數葡萄籽被當作廢料處理。由于葡萄籽蛋白質具有與其他油籽和谷物相似的營養特性，越來越多的學者考慮如何利用葡萄籽蛋白質的營養品質。此外，葡萄籽蛋白質具有良好的溶解性和乳化活性，也可用于食品的生產開發［3］，應用前景 廣闊。

隨著生物技術的發展，蛋白質提取方法越來越多。堿性提取法作為一種常規方法，其工藝簡單，但蛋白質提取率和效率較低，限制了其應用。近年來，食品工業在提高各種來源的蛋白質提取率方面作出了巨大努力。超聲波技術在蛋白質提取方面顯示出優勢，這是由于其能夠通過促進質量傳遞和由于聲空化的影響可能導致的細胞壁破裂來增強提取功效。超聲波是一種安全、廉價、可重復和可靠、無創和環境友好的技術，還能大大提高生物活性水解物的酶效率和活性。離子液體是一種新型綠色的萃取分離體系，具有黏度低、不易乳化、得率高、萃取化合物范圍廣、反應條件溫和等 優點［4,5］。

本研究通過正交實驗對超聲波輔助離子液體提取葡萄籽蛋白質各參數進行優化，為葡萄籽蛋白質進一步研究提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

葡萄籽由甘肅莫高實業發展股份有限公司提供，［Bmim］Cl購自中國科學院蘭州化學物理研究所（質量分數＞99%），牛血清白蛋白購自上海源葉生物科技有限公司；濃鹽酸，1 mol/L的NaOH，考馬斯亮藍G-250等皆為分析純。

1.2 主要儀器設備

微型植物試樣粉碎機（河北省黃驊市中興儀器有限公司）；HH-2數顯超級恒溫水浴鍋（深圳市唯品精密儀器有限公司）；H0503型電子天平（邢臺智冠機械科技有限公司）；GD820HT小型超聲波清洗器（深圳市光點超聲波設備有限公司）；6-10R高速離心機冷凍離心機（湖南恒諾儀器設備有限公司）；752N紫外-可見分光光度計（濟南 好來寶醫療器材有限公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 脫脂葡萄籽粉末的制備將葡萄籽粉碎后用正己烷/乙醇（體積比3∶1）在40℃下持續攪拌6 h脫脂，脫脂溶劑每2 h更換一次。通過過濾處理的葡萄籽粉末在室溫下晾干備用。

1.3.2 離子液體提取葡萄籽蛋白質將脫脂葡萄籽粉末與一定濃度的［Bmim］Cl按照一定料液比混合后，采用一定功率超聲波處理一定時間后，過濾取上清液，采用Bradford法測定蛋白質含量，按照以下公式計算蛋白質得率：

其中m1為上清液中蛋白質質量；m2為加入的葡萄籽粉末的質量；V1為測上清液中蛋白質含量時的上清液體積；V2為總上清液體積。

1.3.3 單因素試驗采用超聲波輔助離子液體提取葡萄籽中蛋白質。分別評價［Bmim］Cl濃度（20%、25%、30%、35%、40%、45%）， 料液 比［1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35 （g/mL）］，pH值（2、4、6、8、10），超 聲 功 率 （20 W、30 W、40 W、50 W、60 W、70W），超聲溫度（20℃、25℃、30℃、35℃、40℃），超聲時 間（3 min、5 min、7 min、9 min、11 min）對蛋白質得率的影響，以獲得蛋白質提取率的最 大值。

1.3.4 正交試驗以［Bmim］Cl濃度、料液比、超聲功率、pH為變量，采用正交試驗設計確定變量的最佳組合。正交試驗因素水平設計，見 表1。

表1 正交試驗因素水平表

2 結果與討論

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 [Bmim]Cl濃度對葡萄籽蛋白質得率的影響在料液比為1∶25（g/mL）、pH為6、超聲功率為40 W、超聲溫度為30℃、超聲時間為5 min的條件下，改變［Bmim］Cl濃度，對葡萄籽蛋白質得率的影響如圖1所示。

如圖1所示，蛋白質得率隨［Bmim］Cl濃度的增加呈先增加后降低的趨勢。離子液體溶液的濃度對細胞壁的溶脹和破壞以及提取液的傳質過程有很大影響，能直接決定萃取劑對目標化合物的提取效率。此外，當離子液體的濃度超過一定值時，黏度過高的萃取劑會阻礙目標化合物從葡萄籽粉末到溶液的分散［6］，從而使傳質過程更加困難，因此，［Bmim］Cl濃度以35% 為宜。

2.1.2 料液比對葡萄籽蛋白質得率的影響

由圖2可知，葡萄籽蛋白質得率隨料液比的減小呈先增加后平緩的趨勢。這可能是因為料液比的減小促使葡萄籽粉末與液體接觸更加完全，使得蛋白質更容易溶于提取液中；但當料液比過小時，葡萄籽蛋白質均已溶于離子液體中，蛋白質得率不發生明顯變化。故料液比為1∶30時 蛋白質得率最佳。

2.1.3 pH對葡萄籽蛋白質得率的影響一定濃度離子液體溶液的pH是影響蛋白質提取效果的一個重要因素。結果表明，隨著萃取劑pH值的增加，對蛋白質選擇性呈現先升高后降低的趨勢（圖3），這是蛋白質與離子液體間是氫鍵和靜電相互作用的結果［6］。此外，由于萃取劑在調節其酸堿度之前是酸性的，當萃取劑的堿性過強時，大量離子液體會從溶液中沉淀出來，進而影響萃取效果。因此，將離子液體溶液pH調節至6 為宜。

2.1.4 超聲功率對葡萄籽蛋白質得率的影響

由圖4可知，隨著超聲功率的增加，析出的葡萄籽蛋白質也就更多；當超聲功率為40 W時，蛋白質得率達到最大值；但當超聲功率太大時，部分蛋白質可能會變性［7］，與不溶物一起被離心除去。因此，最優超聲功率為40 W。

2.1.5 超聲溫度對葡萄籽蛋白質得率的影響

由圖5可知，超聲溫度在20～35℃范圍內，葡萄籽蛋白質得率逐漸升高，之后蛋白質得率隨超聲溫度繼續升高而呈現下降趨勢。這可能與溫度提高后，蛋白質分子運動加速促使其結構拓展［8］，從而可以更快地從原料中分離蛋白質，提高蛋白質提取率有關。但過高的提取溫度會引起蛋白質變性和凝膠化，對蛋白質提取產生不利影響。因此，最適宜的超聲溫度為35℃。

2.1.6 超聲時間對葡萄籽蛋白質得率的影響

由圖6可知，超聲時間從3 min到11 min， 葡萄籽蛋白質得率呈現先升高后降低的趨勢。當超聲時間為7 min時，蛋白質得率達到最高值。說明適當延長超聲時間有利于增加蛋白質的傳質效果。超聲時間過長可能導致蛋白質提取率降低，這與蛋白質聚集和變性有關［9］。

2.2 正交試驗

在利用超聲輔助［Bmim］Cl提取葡萄籽蛋白質的單因素試驗分析的基礎上，進行L9（34）的正交試驗，對提取蛋白質的最佳工藝進行探討。正交試驗分析，見表2。

表2 正交試驗結果

如表2所示，［Bmim］Cl濃度極差R值最大，說明其對蛋白質提取的率影響最為重要，其次為料液比、超聲功率、pH值；依據各因素K值大小，最優組合為A2B1C2D3；在此最優條件下進行多次重復試驗，葡萄籽蛋白質的平均得率高于正交試驗中的任一組合，最高達9.626 mg/g。

3 結論

本實驗建立了一種超聲輔助離子液體提取葡萄籽蛋白質的方法，按照料液比1∶25比例加入35%的［Bmim］Cl，在pH為7、超聲功率為50 W條件下，葡萄籽蛋白質的得率為9.626 mg/g，可為葡萄籽蛋白質功能特性的進一步研究提供參考依據。