實驗性變態反應性腦脊髓炎小鼠胸腺中MOG特異性胸腺細胞分化機制探討

張俊華，高云，馬衛國，許青霞

(鄭州大學附屬腫瘤醫院 檢驗科，鄭州 450008)

實驗性變態反應性腦脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE)是多發性硬化(multiple sclerosis，MS)的理想動物模型[1]。MS是主要由T細胞介導的自身免疫性疾病，其中CD4+T細胞在疾病發展過程中發揮重要作用[2]，同時CD8+T細胞甚至B細胞在EAE發病過程中的作用也逐漸被發現[3]。胸腺是T細胞分化發育成熟的主要器官[4]，T細胞在胸腺內的分化發育可分為3個階段：即CD4CD8雙陰性(double negative，DN)細胞階段；CD4CD8雙陽性(double positive，DP)細胞階段；CD4單陽性(CD4 single positive，CD4SP)或CD8單陽性(CD8 single positive，CD8SP)細胞階段，它們是由DP細胞經陽性和陰性選擇而分化發育成熟的具有免疫功能的T細胞。已有研究發現，存在胸腺的EAE小鼠在發病高峰期后會有自發恢復期，而摘除胸腺的EAE小鼠將缺失自發恢復期，此現象提示胸腺對EAE小鼠具有免疫調節作用[5-6]。因為關于胸腺對EAE發病機制作用的報道甚少，本研究將探索EAE小鼠胸腺細胞亞群變化，以闡述EAE小鼠髓鞘少突膠質細胞糖蛋白(myelin oligodendrocyte glycoprotein，MOG)特異性胸腺細胞的分化機制，進而為EAE的發病機制研究提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料6～8周齡C57BL/6小鼠25只，體質量20～25 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，飼養在中美(河南)荷美爾腫瘤研究院SPF級動物房中。MOG35-55(肽序列：Met-Glu-Val-Gly-Trp-Tyr-Arg-Ser-Pro-Phe-Ser-Arg-Val-Val-His-Leu-Tyr-Arg-Asn-Gly-Lys)，純度98%，購于上海吉爾生化公司；弗氏完全佐劑(complete Freund's adjuvant，CFA，滅活結核分枝桿菌含量5 mg/mL)購于上海三踏生物科技有限公司；百日咳毒素(pertussis toxin，PT)購于北京聯立信生物技術有限責任公司；大鼠抗小鼠抗體CD4-FITC、CD8-PE購于eBioscience公司；Annexin Ⅴ/碘化丙啶(propidium iodide，PI)凋亡試劑盒購于生工生物工程(上海)股份有限公司；BD FACS Calibur 流式細胞儀購于美國BD公司。

1.2 方法

1.2.1 EAE模型的構建及臨床評分 對21只C57BL/6小鼠兩點背部皮下免疫200 μL乳化劑(5 mg/mL CFA與1.5 mg/mL MOG按照1∶1比例配制，使用乳化管反復推拉混勻，形成油包水樣的乳劑)。免疫后第0和2天經小鼠尾靜脈注射PT稀釋液(200 μL/只，PT試劑2 μL稀釋于PBS緩沖液中)[7]。記錄小鼠的臨床評分，評分標準如下：0，正常小鼠；0.5，尾巴部分癱瘓；1，尾巴完全癱瘓；1.5，一后肢無力；2，兩后肢均無力；2.5，一后肢癱瘓，一后肢無力；3，兩后肢均癱瘓；3.5，前肢無力；4，一前肢無力，一前肢癱瘓；4.5，前肢完全癱瘓；5，死亡。同時對3只對照組小鼠皮下注射PBS。

1.2.2 胸腺單細胞懸液的獲取 EAE誘導后第0、5、10、15天各取3只小鼠，頸椎脫臼處死，打開小鼠胸腔暴露心臟上方白色的胸腺，從根部摘除，觀察胸腺大小。使用剪刀將小鼠的胸腺剪碎，使用研磨棒研磨胸腺組織塊，充分研磨后用70 μm濾網過濾，2 009×g離心5 min，棄上清液，PBS重懸獲得單個胸腺細胞懸液備用。用同樣的方法獲取3只PBS對照小鼠及臨床評分分別為0、1、3.5的小鼠胸腺細胞，并在倒置顯微鏡下使用計數板計數胸腺細胞。

1.2.3 凋亡檢測和FACS分析 按照1.5×106/管的檢測量取胸腺細胞懸液，并根據Annexin Ⅴ/PI試劑盒的操作步驟進行凋亡檢測，標記大鼠抗小鼠抗體CD4-FITC、CD8-PE，使用FlowJo軟件分析胸腺細胞凋亡情況和胸腺細胞亞群DN、DP、CD4SP、CD8SP細胞的比例變化。

2 結果

2.1 胸腺細胞數與EAE病程的關系EAE誘導第9～10天小鼠開始發病并呈現相應的臨床癥狀，第15天左右小鼠發病達到高峰，第20～22天小鼠癥狀開始部分緩解(圖1A)；根據EAE病程，選取具有代表性的4個時間點：EAE誘導后第0天(對照)，第5天(發病前期)，第10天(發病起始期)，第15天(發病高峰期)。計數4組小鼠胸腺細胞數，結果顯示，在EAE誘導后第5天胸腺細胞數顯著升高，第10天和第15天又逐漸降低，其中在發病高峰期的第15天胸腺細胞數最低(圖1B)。

注：A.EAE誘導后臨床評分；B.EAE誘導后第0、5、10、15天胸腺細胞數。與第0天組比較，*P<0.05，**P<0.01。圖1 胸腺細胞數與EAE小鼠病程的關系

2.2 胸腺細胞數與EAE臨床評分的相關性與PBS組比較，0臨床評分組小鼠胸腺細胞數顯著升高(P<0.05)，且0、1、3.5臨床評分組小鼠間的胸腺細胞數差異具有統計學意義(P<0.05，表1)。

表1 PBS組小鼠和臨床評分0、1、3.5組小鼠胸腺細胞數的比較

2.3 胸腺細胞亞群凋亡分析EAE誘導后第5天胸腺細胞凋亡率開始升高，第10天凋亡率最高，達到8%左右，并且與第0天比較，差異具有統計學意義(P<0.005)，然而第15天又急劇下降至第0天的水平(圖2A)。另外，對凋亡率最高的第10天小鼠進行胸腺細胞亞群凋亡率分析，發現凋亡率最高的是DP細胞，CD4SP、CD8SP細胞次之，DN細胞最低(圖2C)，且其他3類細胞凋亡率與DP細胞凋亡率差異均具有統計學意義(P<0.05，圖2B)。

注：A.4組小鼠胸腺細胞凋亡比例；B～C.DN、DP、CD4SP、CD8SP細胞亞群的凋亡分析。*P<0.05。圖2 胸腺細胞凋亡分析

2.4 EAE誘導后胸腺細胞亞群分析DN、CD4SP、CD8SP細胞在EAE誘導后比例逐漸升高，DP細胞則逐漸降低(P<0.05，圖3)。

注：A.4組小鼠胸腺細胞亞群流式分析；B.4組小鼠胸腺細胞亞群統計分析。第0、5、10、15天4組小鼠比較，*P<0.05。圖3 EAE誘導后胸腺細胞亞群分析

3 討論

MS是一種免疫系統介導的中樞神經系統脫髓鞘疾病[8-9]，其中髓鞘主要浸潤細胞為T細胞[10]。用于MS研究最廣泛的動物模型是EAE大鼠或小鼠，其主要致病細胞是Th1和Th17[11]，但EAE潛在的發病機制尚不清楚。胸腺是重要的淋巴器官之一，骨髓來源的祖細胞在這里經歷增殖分化，最終產生功能性T細胞[12]。另外，胸腺是控制器官特異性的自身免疫中心，既通過陽性選擇獲得MHC限制性，也通過陰性選擇獲得自身免疫耐受性[13]。有研究發現，切除新生豚鼠的胸腺可以防止或明顯延遲EAE癥狀的出現[14]；相似的，有研究證實T細胞是產生EAE體征和組織學損傷所必需的[15]，綜上可知，MS患者的胸腺功能可能發生了變化。為了更好地闡述EAE誘導后胸腺發生的變化，尤其是胸腺來源MOG特異性T細胞的變化，本研究分析了4個病程時間點——EAE誘導后第0天(對照)、第5天(發病前期)、第10天(發病起始期)和第15天(發病高峰期)的胸腺細胞變化，主要是胸腺細胞亞群變化及凋亡情況，這些對胸腺細胞在EAE誘導后的增殖分化過程的研究將有助于EAE發病機制的闡明。

本研究發現，在EAE誘導后第5天胸腺細胞數顯著升高，第10天和第15天又明顯下降，可以認為小鼠在誘導物MOG抗原的早期作用下先動員了胸腺細胞的增殖分化。另外本研究發現，臨床評分越高的小鼠胸腺細胞數越低，這與很多學者證實的EAE小鼠胸腺萎縮結論相一致[5]，在其他MS模型中也有發現胸腺萎縮，如大鼠EAE模型[16]、患有原發性進展性EAE的A.SW小鼠[17]等。因為胸腺是T細胞分化發育成熟的器官[18]，在胸腺細胞中，DP細胞通過陽性選擇分化發育為單陽性細胞，而未通過陽性選擇的DP細胞全部凋亡，故進一步研究胸腺細胞的凋亡情況。本研究發現，EAE誘導后胸腺細胞凋亡率開始升高，在EAE誘導后第10天凋亡率達到最高，第15天又下降。另外，本研究還發現，凋亡率最高的第10天小鼠其主要凋亡細胞亞群是DP細胞。這一數據說明，EAE誘導后至發病起始期胸腺細胞中DP細胞的陽性選擇進程加快，也就是胸腺細胞分化發育成熟為MOG特異性效應T細胞的速度加快。為了進一步獲得EAE誘導后胸腺細胞亞群的動態變化，本研究利用FACS發現，除了DP細胞比例在EAE誘導后逐漸減少，DN、CD4SP、CD8SP細胞的比例在EAE誘導后都逐漸升高，這一數據也與前面DP細胞凋亡最嚴重的結果相一致。

綜上所述，EAE誘導后至發病初始階段胸腺細胞中MOG特異性胸腺細胞增殖加快，凋亡率增加，其可能機制為在疾病發生之前MOG抗原通過加速對胸腺內DP細胞的陽性選擇來產生更多MOG特異性效應T細胞，這些細胞隨著疾病的進展最終遷移至致病部位并表現出相應的臨床癥狀。本研究能夠詳細地描述EAE誘導后MOG特異性胸腺細胞亞群的動態變化，可為闡述EAE發病機制提供幫助。