系統性紅斑狼瘡患兒血清抗內皮細胞抗體檢測的臨床意義

高嶺，王莉，殷絲雨，劉麗莎

(1.南京醫科大學附屬兒童醫院 檢驗科，南京 210008；2.皖南醫學院 醫學檢驗系，蕪湖 241002)

系統性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus，SLE)是一種常見的系統性自身免疫性疾病，主要病理改變為血管炎性病變，可累及全身多個器官，其病因與發病機制尚不明確。SLE患者體內可產生多種自身抗體，大量免疫復合物沉積是導致內皮損傷和血管炎發生的主要原因[1]。抗內皮細胞抗體(anti-endothelial cell antibody，AECA)是針對血管內皮細胞膜抗原而產生的一組抗體，可在多種血管炎性疾病患者的外周血中檢出，其在SLE病理損傷的作用日益引起人們重視[2]。本研究將對AECA在SLE患兒外周血中的表達情況及其臨床意義作一初步探討，以期尋求有利于SLE患兒疾病診斷及活動性判斷的新標志物。

1 材料與方法

1.1 研究對象選取35例2018年6月—2019年10月在南京市兒童醫院風濕免疫科住院部明確診斷為SLE的患兒為研究對象，其中活動期患兒20例、緩解期15例。患兒均符合《系統性紅斑狼瘡診治指南(草案)》中對SLE的診斷標準[3]，同時排除其他自身免疫性疾病及合并心、肺、腎、腦、造血系統等嚴重疾病者，樣本采集前均未接受藥物治療。SLE疾病活動性的判斷以SLE疾病活動性評分(systemic lupus erythematosus disease activity index， SLEDAI)為標準，≥9分為疾病活動，<9分為病情緩解。同時選取15例擇期手術兒童作為對照組，各組患兒性別、年齡差異無統計學意義(P>0.05)。以上樣本的收集均獲得患兒家屬知情同意和醫學倫理委員會的批準。

1.2 方法

1.2.1 標本采集 分別采集SLE患兒和對照組兒童靜脈血3 mL，采用常規方法分離血清，-70 ℃凍存待用。

1.2.2 血清AECA檢測 采用間接免疫熒光試劑盒(歐蒙醫學診斷有限公司)，以人臍靜脈內皮細胞(human umbilical vein endothelial cell，HUVEC)為底物，樣本1∶10稀釋后檢測血清中IgG型AECA。熒光顯微鏡下在細胞質中可見綠色顆粒熒光判定為陽性，顆粒型熒光在靠近細胞核的位置上顆粒顯得更豐富。同時分別設置陰、陽性對照用于判斷實驗的有效性。

1.2.3 血清dsDNA檢測 采用間接免疫熒光試劑盒(歐蒙醫學診斷有限公司)，樣本1∶10稀釋后檢測血清中dsDNA。同時分別設置陰、陽性對照用于判斷實驗的有效性。

1.2.4 血清免疫球蛋白檢測 采用BNⅡ特種蛋白檢測分析儀(Siemens 公司)速率散射比濁法定量檢測患兒血清中IgA、IgM、IgG和C4的含量。

1.2.5 炎性因子檢測 用AccessⅡ化學發光儀定量檢測患兒血清中可溶性白細胞介素2受體(soluble interleukin 2 receptor，sIL-2R)、IL-6和TNF-α的含量。

1.2.6 尿微量蛋白檢測 采用尿微量蛋白分析儀檢測尿微量白蛋白(microalbuminuria，MA)、尿IgG(urine IgG，IGU)和尿α1微球蛋白(α1 microglobulin，A1M)的含量。

2 結果

2.1 各組患兒血清IgG-AECA陽性率的比較35例SLE患兒中IgG-AECA陽性18例，陽性率為51%，其中20例活動期SLE組患兒中14例外周血IgG-AECA陽性，陽性率為70%，15例緩解期SLE組患兒中4例IgG-AECA陽性，陽性率為33%，15例對照組兒童外周血中IgG-AECA均為陰性。SLE組患兒以及活動期SLE組患兒IgG-AECA陽性率與對照組比較，差異均具有統計學意義(P<0.05)，而緩解期SLE組與對照組比較，差異無統計學意義(P>0.05)。

2.2 SLE組患兒外周血中dsDNA的檢測SLE患兒外周血中dsDNA陽性率為40%，活動期時可高達55%，抗dsDNA和IgG-AECA聯合檢測時陽性率為69%，活動期時可高達90%。SLE患兒特別是活動期患兒使用抗dsDNA和IgG-AECA聯合檢測陽性率高于僅使用抗dsDNA檢測(P<0.05)，表明IgG-AECA在SLE疾病診斷，特別是活動性判斷中具有一定的意義。詳見表1。

表1 SLE患兒外周血中dsDNA陽性率分析

2.3 IgG-AECA陽性組患兒和IgG-AECA陰性組患兒體液免疫相關指標的比較IgG-AECA陽性組患兒外周血中IgA、IgM和IgG水平均高于IgG-AECA陰性組(P<0.05)，C4水平低于IgG-AECA陰性組(P<0.05，表2)。

表2 2組患兒體液免疫相關指標差異分析

2.4 IgG-AECA陽性組患兒和IgG-AECA陰性組患兒炎性因子水平的比較分別觀察2組患兒外周血中常見炎性因子sIL-2R、IL-6和TNF-α的表達情況，可見IgG-AECA陽性組患兒外周血中炎性因子的表達顯著高于IgG-AECA陰性組(P<0.05，表3)。

表3 2組患兒炎性因子水平的比較

2.5 IgG-AECA陽性組患兒和IgG-AECA陰性組患兒纖維蛋白降解產物(fibrin degradation products，FDP)和D-二聚體水平的比較IgG-AECA陽性組患兒外周血中反映凝血系統中纖維蛋白溶解功能的指標FDP和D-二聚體水平明顯高于IgG-AECA陰性組(P<0.05，表4)。

表4 兩組患兒外周血漿中FDP和D-二聚體水平的比較

2.6 IgG-AECA陽性組患兒和IgG-AECA陰性組患兒繼發狼瘡性腎炎 (lupus nephritis，LN)情況分析18例IgG-AECA陽性組患兒中繼發LN 10例，發病率為56%，17例IgG-AECA陰性組患兒中繼發LN 3例，發病率為18%，IgG-AECA陽性組SLE患兒LN患病率高于IgG-AECA陰性組(P<0.05)。

2.7 IgG-AECA診斷LN的ROC曲線分析IgG-AECA診斷LN的ROC曲線，結果顯示，IgG-AECA診斷LN的AUC為0.703(95%CI：0.522～0.883)，靈敏度和特異度分別為0.769和0.636(圖1)。

圖1 IgG-AECA診斷LN的ROC曲線

2.8 LN組患兒AECA陽性與否與其尿微量蛋白表達差異分析分別觀察繼發LN的患兒中IgG-AECA陽性組和IgG-AECA陰性組患兒MA、IGU和A1M的表達情況，可見IgG-AECA陽性組患兒上述3項指標均高于IgG-AECA陰性組患兒(P<0.05)，表明IgG-AECA可加重患兒腎臟的損傷。詳見表5。

表5 LN組患兒AECA陽性與否與其尿微量蛋白表達差異分析

3 討論

SLE是一種原因不明的自身免疫性疾病，病變可累及多種系統、組織和器官。兒童SLE是指青春期前后的SLE，它的發病率在0.4/10萬～0.6/10萬，占所有SLE患者的15%～20%，且亞洲兒童的發病率高于全球水平。與成人相比，兒童SLE起病更急、病情更重、病程更為遷延，且常出現重要臟器損害，當病變累及腎臟系統時稱為LN。SLE在遺傳因素、環境因素、激素水平等多種因素共同作用下引發，但具體的發病機制尚不清楚[4]。作為自身免疫性疾病，SLE發病過程中伴隨著大量自身抗體的產生，抗原抗體復合物可沉積于各組織器官，引起組織器官病理性損傷。患者體內存在的多種自身抗體不僅僅作為疾病診斷的血清標志物，也可作為致病因子參與疾病的發生、發展[5-6]。SLE早期癥狀不典型，易發生誤診， 如能對SLE患者進行早期診斷和治療對改善患者預后具有積極作用。目前，臨床評估SLE常用的特異性體外診斷標志物為抗Sm抗體，是 SLE 的標志性抗體，特異度可達到99%，但靈敏度僅為25%，且出現后持續陽性，與疾病活動性無關。抗dsDNA抗體作為判斷疾病活動性的標志物，靈敏度較差，易發生漏檢。因此，尋求新的可以預測 SLE發生、進展和惡化的生物標志物有利于臨床更好地認識疾病的發生、發展過程。AECA是一種針對內皮細胞(endothelial cell，EC)表面靶抗原的異質性抗體，可表達于多種以血管炎為主要特征的疾病患者外周血中。AECA造成EC損傷的具體機制可能為：AECA激活EC，上調炎性因子、細胞因子和黏附分子等表達，誘導淋巴細胞、單核細胞黏附于EC表面，繼而引起更多淋巴細胞、單核細胞與EC黏附，進一步激活EC導致血管炎的發生[7-8]。AECA可在多種內皮損傷性疾病患者外周血中檢出，如混合性結締組織病(mixed connective tissue disease， MCTD)[9]、肺動脈高壓[10]、風濕性心臟病[11]等。國內外學者對AECA與SLE的關系進行了一些研究，發現在活動期SLE患者外周血中亦可檢測出AECA，其靶抗原主要是鹽酸肝素、DNA或DNA-組蛋白，核糖體P蛋白、核糖體蛋白L6、延長因子Ⅰa、線譜酸環化酶相關蛋白、纖溶酶原活抑制劑、纖維連接素等[12]，表明AECA作為免疫活性物質參與SLE疾病發生、發展過程，即AECA與EC結合后通過一系列信號通路促進炎性介質的產生[13-15]。有研究表明，AECA在SLE以及LN的病理損傷中發揮了一定的作用，與疾病的活動性相關[16-17]。韋薇等[18]的研究結果表明，SLE患者AECA陽性率為36%，但AECA陽性率在是否合并LN患者之間無顯著性差異；劉娜娜等[19]的實驗結果顯示，AECA水平與LN疾病活動程度相關。本研究結果顯示，在SLE患兒體內可檢測出IgG型AECA，且活動SLE患兒陽性率明顯高于緩解期SLE患兒和擇期手術患兒。IgG-AECA陽性組患兒IgG、IgM、IgA水平明顯高于IgG-AECA陰性組患兒，C4水平明顯低于IgG-AECA陰性組患兒。此外，IgG-AECA陽性組患兒D-二聚體和FDP水平較IgG-AECA陰性組明顯升高，炎性因子、尿微量蛋白含量均高于IgG-AECA陰性組患兒。以上結果表明，SLE患兒體內IgG-AECA與相應抗原結合后激活補體系統，通過介導機體免疫功能紊亂、炎性介質釋放、凝血纖溶系統活化等參與疾病的發展過程。此外，IgG-AECA與腎臟EC結合后可引起腎臟功能損傷，尿微量蛋白含量升高，在LN發生、發展中起著一定的致病作用。盡管本研究病例數量較少且只采用了間接免疫熒光法進行檢測，所得結論也會與其它研究存在一定的差異，但現有結果為AECA在SLE患兒致病機制中作用的研究提供了研究依據，為進一步開展深入研究奠定了基礎。綜上所述，IgG-AECA參與SLE的病理過程，對LN的診斷具有臨床指導意義。