抗核糖體P蛋白、抗Smith、抗dsDNA、抗核小體及抗組蛋白抗體對系統性紅斑狼瘡的臨床價值探討

王艷萍，鄒麟，郭婷，陳曦，史靜，陳瀑

(重慶醫科大學附屬第一醫院 檢驗科，重慶 400016)

系統性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus， SLE)是一種由抗自身抗體介導、累及全身結締組織的疾病，其病因及發病機制復雜，好發于中年女性患者[1]。SLE的臨床表現多樣，常累及皮膚、關節、腎臟、中樞神經系統等重要組織和器官。多數患者在疾病初期臨床癥狀較輕，僅出現1～2個器官受損，后逐漸轉變為多器官病變；也有部分患者早期便出現多器官損傷甚至狼瘡危象[2]。

SLE患者血清中存在多種自身抗體，這些抗體與SLE患者的疾病進展、活動度及臨床表現密切相關，但與SLE發生發展直接相關的抗體并不多[3]。目前，抗Smith抗體(anti-Smith antibody，anti-Sm)、抗dsDNA抗體(anti-dsDNA)已被廣泛運用于SLE的臨床診斷中。anti-Sm是SLE的標志性抗體，其與SLE疾病活動度無明顯相關性，治療后仍持續陽性[4]；抗dsDNA抗體與狼瘡腎炎(lupus nephritis， LN)的發生密切相關，并被證實與SLE的疾病活動度也有很大相關性[5-6]。另有一些研究表明，抗核糖體P蛋白抗體(anti-ribosomal P protein antibody，anti-P)、抗核小體抗體(anti-nucleosome antibody，ANuA)和抗組蛋白抗體(anti-histone antibody， AHA)也是SLE特異性抗體，其中anti-P與神經精神性狼瘡有關[7]，ANuA與LN有一定相關性[8]，而AHA可能與藥物性狼瘡有關。因此，本研究旨在系統性比較anti-P、anti-Sm、anti-dsDNA、ANuA和AHA對SLE的診斷價值，并進一步探討這5種自身抗體與SLE患者的臨床表現及疾病活動度的相關性。

1 資料與方法

1.1 研究資料收集并回顧性分析2016年1月—2018年12月于重慶醫科大學附屬第一醫院收治的351例SLE患者，200例非SLE自身免疫性疾病患者(non-SLE)和100例健康對照者(healthy control， HC)的臨床資料，其中SLE患者納入標準符合修訂版1997年美國風濕病學會SLE分類標準，在資料的收集整理過程中篩選首次于該院治療患者的臨床數據，剔除無效和重復數據。本研究經重慶醫科大學附屬第一醫院醫學倫理委員會審核批準，所有患者均了解研究內容并簽署知情同意書。狼瘡腎炎(lupus nephritis， LN)除滿足SLE的診斷標準，還需符合以下3項診斷標準中至少1項：(1)蛋白尿持續陽性，24小時尿蛋白定量>0.5 g，或隨機尿檢查尿蛋白呈強陽性(+++)，或尿蛋白/肌酐比值>500 mg/g(50 mg/mmol)；(2)尿液中檢出細胞管型，包括紅細胞管型、血紅蛋白管型、顆粒管型、管狀管型和混合管型；(3)有活動性尿沉渣[除尿路感染外，尿白細胞>5 個/高倍視野(high power field， HPF)，尿紅細胞>5 個/HPF]，或尿液中存在紅細胞、白細胞管型。腎活檢病理檢查顯示免疫復合物介導的腎小球腎炎則進一步確診為LN[9]。non-SLE組包括130例類風濕關節炎、25例干燥綜合征、5例自身免疫性肝炎、20例原發性膽汁性膽管炎、4例混合性結締組織病和16例皮肌炎患者。HC無任何疾病史，包括結締組織病。

1.2 觀察指標

1.2.1 臨床表現 在患者首次入院并未接受過任何治療前統計其一般臨床資料如性別、年齡、有無高血壓、糖尿病等基礎疾病史。同時，記錄其是否有皮膚紅斑、蝶形紅斑、盤狀紅斑、皮疹或光敏感，是否出現脫發、關節炎、漿膜炎、口腔潰瘍等臨床表現以及是否有眩暈、記憶力減退甚至癲癇等神經精神性狼瘡癥狀或典型的LN表現。

1.2.2 實驗室檢查指標 采用非抗凝管分別抽取患者外周靜脈血4 mL，2 775×g離心15 min后，分離血清用于anti-P、anti-Sm、anti-dsDNA、ANuA和AHA以及補體C3、C4水平的檢測，若不能及時檢測則分離血清分裝后于-20 ℃低溫冷凍備用。

1.2.3 SLE疾病活動指數(SLE disease activity index，SLEDAI)評分 用SLEDAI-2000積分評估疾病活動度，評分細則及評判標準如下(表1)。

表1 SLEDAI-2000積分類目及活動度評判標準

1.3 患者血清自身免疫性抗體水平的檢測如1.2.2所述檢測患者外周靜脈血樣本血清自身免疫性抗體及補體水平。其中，采用間接免疫熒光法檢測anti-dsDNA：(1)在包被有綠蠅短膜蟲的生物載片中加入25 μL 1∶11稀釋的血清，室溫孵育30 min；(2)用PBS流動沖洗生物載片并浸泡載片5～10 min；(3)于每張生物載片中加入25 μL 羊抗人IgG-FITC抗體，室溫孵育30 min；(4)重復步驟(2)；(5)于每張生物載片表面滴加1滴甘油后封片。anti-P、anti-Sm、ANuA和AHA的檢測采用EUROIMMUN全自動免疫印跡分析儀，所有自身抗體的檢測試劑均購自歐蒙醫學診斷(中國)有限公司。血清補體C3、C4采用貝克曼庫爾特IMMAGE 800全自動特定蛋白分析儀檢測。

1.4 統計學處理采用SPSS 19.0統計軟件分析數據，定性資料以n(%)表示，使用χ2檢驗或Fisher確切概率法分析；定量資料以中位數M(P25，P75)表示，采用兩個獨立樣本的非參數檢驗Mann-WhitneyU檢驗；兩變量間的相關性檢測采用Spearman相關性分析。檢驗水準(α)為0.05。

2 結果

2.1 anti-P、anti-Sm、anti-dsDNA、ANuA和AHA對SLE的診斷價值

2.1.1 anti-P、anti-Sm、anti-dsDNA、ANuA和AHA在不同組別中的陽性率 5種自身免疫性抗體在SLE組、non-SLE組和HC組中的陽性率如下，其中SLE組的陽性率顯著高于non-SLE和HC組(均P<0.01，表2)。

表2 anti-P、anti-Sm、anti-dsDNA、ANuA和 AHA在不同組別中的陽性率

2.1.2 anti-P、anti-Sm、anti-dsDNA、ANuA和AHA對SLE的診斷價值比較 5種抗體對SLE的診斷特異度均大于95.0%，但靈敏度相對較低，5種抗體任一陽性檢測的靈敏度可達70.1%(表3)。同時，經統計單一 anti-P、anti-Sm、anti-dsDNA、 ANuA 和AHA陽性在這5種抗體總陽性SLE患者中所占的百分比分別為26.8%、31.5%、20.8%、8.6%和7.8%(數據不充分，暫不列表中)。

表3 anti-P、anti-Sm、anti-dsDNA、ANuA和 AHA對SLE的診斷價值

2.2 anti-P、anti-Sm、anti-dsDNA、ANuA和AHA與SLE臨床特征的關系anti-P、anti-Sm、anti-dsDNA和AHA陽性組和陰性組在SLE發病年齡上差異有統計學意義(均P<0.05)；anti-P陽性組皮膚紅斑發生率較高，ANuA陽性組脫發發生率較高，anti-dsDNA、ANuA和AHA陽性組LN發生率更高，且與陰性組相比差異均有統計學意義(均P<0.05)(表4)。

表4 anti-P、anti-Sm、anti-dsDNA、ANuA和 AHA與SLE臨床特征的關系

2.3 anti-P、anti-Sm、anti-dsDNA、ANuA和AHA與SLE疾病活動度的關系除anti-Sm外， anti-P、anti-dsDNA、ANuA和AHA陽性組與陰性組比較有更高的SLEDAI，差異有統計學意義(均P<0.05，表5，圖1)。其中anti-P和anti-dsDNA滴度在無活動，輕、中、重度活動組患者中的百分比差異都有統計學意義(均P<0.01，表5，圖1)。補體C3、C4水平在5個抗體陽性組和陰性組之間差異都具有統計學意義(均P<0.01，表5)。Spearman相關性分析顯示SLEDAI與C3濃度存在顯著負相關性(r=-0.395，P=0.000)，與C4水平也存在顯著負相關性(r=-0.314，P=0.000)(圖2)。

表5 anti-P、anti-Sm、anti-dsDNA、ANuA和AHA分組與SLEDAI及血清補體水平的關系

圖1 anti-P、anti-Sm、anti-dsDNA、ANuA和AHA不同分類下SLEDAI的分布

圖2 SLEDAI評分與補體C3、C4水平的相關性

3 討論

本研究全面地回顧性分析比較了anti-P、anti-Sm、anti-dsDNA、ANuA和AHA對SLE的診斷價值。通過表2和表3的數據可知，這5種抗體對SLE的診斷都具有很高的特異度，但靈敏度欠佳，與其他研究結果一致[10]。值得注意的是，這5種抗體任意一種陽性時診斷SLE的靈敏度可提高至70.1%而特異度仍然保持在92.3%，準確度也可達80.3%。這說明anti-P、anti-Sm、anti-dsDNA、ANuA和AHA的聯合檢測與單個抗體檢測相比可明顯提高診斷的靈敏度和陰性預測值，減少漏診，同時特異度和陽性預測值也不會有明顯的降低。但是，這5種抗體整體的靈敏度較其他研究略低，可能是方法學的原因造成的，本研究中anti-P、anti-Sm、ANuA 和 AHA是采用Western blotting檢測的，而anti-dsDNA是采用間接免疫熒光法檢測的。其實，對于SLE的特異性抗體的檢測，優先推薦ELISA、蛋白芯片或者化學發光法等重復性和穩定性更好的檢測方法[11-12]。但是為了能夠篩查多種系統性結締組織病，目前中國的大型三甲醫院實驗室普遍都采用能夠一次性檢測多種自身抗體的Western blotting試劑。這種檢測方法相較于其他幾種方法的試劑靈敏度可能要差一些，并且由于多種抗體同時檢測也不能完全避免交叉反應。但是Western blotting試劑能夠一次性同時檢測10多種自身抗體，縮短檢測時間，對于系統性結締組織病的篩查效率要明顯高于其他方法。本研究進一步分別分析了這5種自身抗體單個陽性占整體陽性SLE患者的百分比，發現相比于ANuA和AHA，anti-P、anti-Sm和anti-dsDNA單個抗體陽性檢出率更高，單獨檢測的意義較大。

研究第二部分進一步分析了anti-P、anti-Sm、anti-dsDNA、ANuA和AHA與SLE臨床特征的關系，由于每種抗體陽性組中同時也包含有其他陽性抗體，并沒有進行兩兩抗體間臨床特征的比較，而是單純就某種抗體陽性和陰性組SLE患者的臨床表現進行了分析。結果顯示，anti-P、anti-Sm、anti-dsDNA和AHA陽性組患者發病年齡較陰性組更小(均P<0.05)，與 Olesińska等[13]的研究結果一致；而其中anti-P陽性組的發病年齡最小，中位年齡僅39歲。Reichlin等[14]的研究也顯示，anti-P在青少年期發病的SLE患者中陽性率為42%，遠遠高于成年期發病的SLE患者(7.7%)，進一步證實了本研究的觀點。目前尚未有研究發現其具體機制，僅發現年幼期發病的SLE患者anti-P陽性率更高并且臨床癥狀更嚴重，其具體原因還需深入探索。

本研究中，anti-P陽性和陰性組皮膚紅斑的發生率分別為31.3%和19.7%，差異顯著(P<0.05)，表明anti-P陽性與SLE患者皮膚損傷有關。國內外也有研究發現，anti-P陽性的SLE患者面部紅斑和光敏感發生率更高[15]。與沒有皮膚病變的患者相比，有皮膚損傷的SLE患者自身抗體的陽性率更高，這可能與兩種特異性抗原(酸性核糖體P0蛋白和半乳凝素3)有關[16]，然而由這2種抗原介導的皮膚損傷的分子機制仍需進一步探索。ANuA陽性組脫發發生率較陰性組顯著升高(P<0.05)。脫發是SLE患者常見的非特異性皮膚表現之一，其發生率為17.3%～54.0%，主要是非瘢痕性脫發，脫發是疾病加重的非特異性表現，還能預測SLE的復發[17]。目前關于自身抗體與SLE脫發這方面的研究并不多，查閱相關文獻后沒有發現ANuA與SLE脫發相關性的報道。但國內的一項大樣本研究發現缺乏抗可提取核抗原抗體(包括ANuA) 的SLE患者，其脫發的患病率比其他患者低[18]。

LN是SLE患者最常見的并發癥，50%～70%的SLE患者發生臨床腎臟受累，腎功能衰竭也是重要死因。本研究結果顯示，anti-dsDNA、ANuA和AHA陽性組SLE患者更容易出現LN，與其他研究結果一致[19]。anti-dsDNA是SLE高度特異性抗體，與dsDNA結合后形成免疫復合物沉積于腎臟，誘發免疫反應，引起腎臟損傷。核小體是染色體的基本結構單位，組蛋白是核小體的重要組成部分，ANuA不僅能與染色質表面暴露的組蛋白抗原表位結合，還能結合dsDNA及dsDNA與組蛋白相互作用產生的構象表位，形成免疫復合物沉積于腎臟；其又在核小體的介導下使ANuA結合至腎小球基底膜上，激活補體系統，引起LN[20]。在SLE小鼠模型中，ANuA還可誘導AHA和anti-dsDNA的產生。因此，anti-dsDNA、ANuA和AHA三者相輔相成，共同導致LN的發生。

目前，臨床醫生主要通過SLEDAI評估SLE患者的疾病活動性。同時，在SLE患者中，自身抗體與相應抗原結合后沉積在組織器官中，激活補體產生炎癥反應從而降低血清補體水平，因此，補體C3、C4水平也常常用于反映SLE的活動性[21]。本研究中，除anti-Sm，anti-P、anti-dsDNA、ANuA和AHA陽性組的SLEDAI都顯著高于陰性組(有P<0.05)，說明這4種抗體都與SLE的疾病活動性有關。進一步按照SLEDAI評分將5種抗體陽性組和陰性組的SLE患者再細分為無活動、輕、中、重度活動4組，發現anti-P和anti-dsDNA在4組患者的分布上差異顯著(均P<0.01)，ANuA在無活動和重度活動度患者中分布有顯著性差異(均P<0.01)，而AHA只在無活動患者中分布有統計學差異(P<0.05)。在疾病活動度的分布上anti-P和anti-dsDNA有較好的一致性，中度和重度活動度患者在其陽性組中所占的百分比分別達72.4%和66.6%，說明anti-P可以和anti-dsDNA一樣作為反映SLE疾病活動度的指標，并且陽性與SLE的高疾病活動度有關。C3、C4水平在5個抗體陽性組和陰性組之間都有顯著差異(均P<0.01)，并且與SLEDAI評分存在顯著負相關性(P<0.01，r<-0.300)。但是C3、C4濃度在SLEDAI沒有顯著差異的anti-Sm陽性組和陰性組之間也存在統計學差異，并且與SLEDAI的相關性系數分別只有-0.395和-0.314，為弱負相關性。這說明補體C3、C4可在一定程度上反映SLE的疾病活動度，但直接作為SLE疾病活動度的判斷指標可能還不夠理想。

綜上所述，anti-P、anti-Sm、anti-dsDNA、ANuA 和 AHA 對SLE的診斷具有較高的特異度，但靈敏度較差，聯合檢測可大大提高SLE的診斷準確率。抗核抗體、抗磷脂抗體(包括抗心磷脂抗體、抗β2糖蛋白1抗體和狼瘡抗凝物)以及補體C3、C4對于SLE的診斷也具有重要意義，需同時檢測。相比于ANuA和AHA，anti-P、anti-Sm和anti-dsDNA單個抗體陽性率更高。anti-P、anti-Sm、anti-dsDNA和AHA陽性的SLE患者發病年齡更小，anti-P陽性與SLE皮膚紅斑發生率有關，ANuA陽性與SLE脫發可能存在一定關聯，而anti-dsDNA、ANuA和AHA陽性時LN的發生率更高。anti-P、anti-dsDNA、ANuA和AHA都與SLE的疾病活動度有關，anti-P可以和anti-dsDNA一樣作為反映SLE疾病活動度的指標，并且與SLE的高活動性有更大關聯。補體C3、C4可以在一定程度上反映SLE的疾病活動性，但直接作為SLE疾病活動度的判斷指標可能還不夠理想。