小陷胸湯對高血脂小鼠血脂及免疫功能的影響

曾江琴，孫勤國，徐鴻婕，丁曉明，牟艷杰，蔣躍文

(1. 武漢市第三醫院 中醫科，武漢 430060；2. 湖北中醫藥大學 中醫臨床學院，武漢 430061)

高脂血癥(hyperlipidemia，HLP)是指由于機體血脂水平過高導致的全身性脂質代謝紊亂性疾病，會誘發冠心病、腦栓塞、動脈粥樣硬化等一系列心腦血管疾病[1-2]。隨著生活水平的提高，高蛋白、高脂肪食物的攝取量日益增多，同時缺乏運動，導致體內脂質過度積累，形成HLP[3]。HLP是中老年人的常見病，近些年發現，患病人群仍在不斷增加并呈逐漸年輕化發展[4]。因此，調控脂質代謝，降低血脂水平對于心腦血管疾病的防治具有重要意義[5]。他汀類藥物是臨床上治療HLP的主要藥物，但其治療靶點單一，長期服用存在多種不良反應[6]。因此，探尋有效且安全的HLP治療藥物具有重要意義。

在中醫學上，HLP被認為屬于“痰濁”、“瘀血”等范疇[7]。小陷胸湯最早出自《傷寒論》，由黃連、瓜蔞、半夏三味藥組成，具有清熱化痰、寬胸散結的功效[8]。本研究以高脂飼料喂養小鼠建立HLP模型，探究小陷胸湯對模型小鼠血脂以及免疫功能的影響，旨在為HLP的防治提供新的方向和理論參考。

1 材料

1.1 實驗動物36只5周齡SPF級雄性C57BL/6小鼠，體質量20～22 g，購自三峽大學實驗動物中心。小鼠飼養于22～26 ℃，相對濕度50%～60%環境中，晝夜交替照明12 h/12 h。

1.2 實驗藥物小陷胸湯(黃連3 g、瓜蔞30 g、半夏12 g)，由武漢市第三醫院中藥房提供，用傳統方法浸泡、煎煮、過濾、濃縮，制成煎劑，調制至每毫升含生藥0.12、0.06及0.03 g(根據人與小鼠體表面積換算得出的劑量)，低溫冷藏備用。

1.3 實驗試劑洛伐他汀，購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；高脂飼料，購自北京華阜康生物科技股份有限公司；總膽固醇(total cholesterol，TC)、甘油三酯(triglyceride，TG)、低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein cholesterol，LDL-C)及高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein cholesterol，HDL-C)檢測試劑盒，購自深圳邁瑞生物醫療電子股份有限公司；小鼠血清CRP ELISA檢測試劑盒，購自武漢貝茵萊生物科技有限公司；PBS、鈣離子載體離子霉素、布雷非德菌素A(brefeldin A，BFA)，購自北京索萊寶科技有限公司；佛波酯(phorbol myristate acetate，PMA)購自Sigma-Aldrich公司；小鼠抗CD40-FITC、抗CD40L-PE、抗IL-4-PE、抗IFN-γ-PE、抗CD4-FITC抗體，購自eBioscience公司；破膜劑，購自BD公司。

1.4 實驗儀器全自動生化分析儀，購自深圳邁瑞生物醫療電子股份有限公司；酶標儀，購自Labsystems公司；CO2常溫培養箱，購自賽默飛世爾科技有限公司；FACS，購自艾森生物(杭州)有限公司 。

2 方法

2.1 HLP小鼠模型的構建適應性飼養7 d后，對照組小鼠飼喂基礎飼料，模型組飼喂高脂飼料。飼喂8周后，夜間饑餓處理對照組和模型組小鼠，尾靜脈取血，檢測血清中TC和TG水平，模型組與對照組相比差異有統計學意義即為HLP模型構建成功。

2.2 分組和給藥將小鼠隨機分為6組：陰性對照組、模型組、低劑量組、中劑量組、高劑量組和陽性對照組，每組6只。除陰性對照組外，其余各組小鼠均進行HLP模型的構建。建模成功后，低、中、高劑量組小鼠分別灌胃0.03、0.06和0.12 g/mL小陷胸湯，陽性對照組小鼠灌胃2.5 mg/kg洛伐他汀，陰性對照組和模型組小鼠灌胃等量生理鹽水。給藥頻率為1次/d，連續8周。末次給藥結束后，稱取各小鼠體質量。1%戊巴比妥鈉麻醉小鼠，處死后采集小鼠主動脈血液分離血清并收集小鼠脾臟、肝臟及主動脈血管組織，計算肝臟、脾臟指數。

肝臟指數=(肝質量/體質量)×100%；脾臟指數=(脾質量/體質量)×100%

2.3 小鼠血清TC、TG、LDL-C和HDL-C水平的檢測采用全自動生化分析儀測定小鼠血清中TC、TG、LDL-C和HDL-C水平，操作嚴格按照生化試劑盒說明書進行。

2.4 FACS檢測血管組織CD40+/CD40L+細胞百分比取各組主動脈血管組織樣本，用含5%雙抗的PBS漂洗后剪碎組織塊，經0.25%胰酶及0.1% Ⅱ型膠原酶(體積比1∶1)37 ℃消化20 min。收集單細胞懸液，175×g離心10 min，棄上清液，PBS漂洗后備用。用100 μL 流式緩沖液重懸細胞，取1×106個細胞于1.5 mL離心管中，每管加入2 μL 抗CD40-FITC和抗CD40L-PE抗體，4 ℃避光孵育30 min；400×g離心5 min，棄上清液；400 μL PBS重懸細胞，使用FACS檢測。

2.5 FACS檢測脾臟組織Th1、Th2百分比取各組小鼠脾臟組織樣本，剪碎，37 ℃消化30 min，收集細胞懸液。經200目不銹鋼網過濾，175×g離心10 min，棄上清液，PBS漂洗1次。取1×106個細胞于1.5 mL離心管中，每管加入2 μL PMA(50 ng/mL)、離子霉素(2 μg/mL)和BFA(3 μg/mL)的混合物，培養6 h。PBS漂洗1次，4 ℃、400×g離心5 min，棄上清液；100 μL流式緩沖液重懸細胞，加入2 μL抗CD4-FITC抗體，4 ℃避光孵育30 min；加入1 mL固定劑，避光孵育20 min，4 ℃、400×g離心5 min，棄上清液；加入1 mL破膜劑，避光孵育40 min，4 ℃、400×g離心5 min，棄上清液；PBS重懸細胞，加入2 μL抗IFN-γ-PE、抗IL-4-PE抗體，4 ℃避光孵育45 min；400 μL PBS重懸細胞，使用FACS檢測。

2.6 ELISA檢測小鼠外周血CRP水平按照ELISA檢測試劑盒說明書進行操作，稀釋標準品，繪制標準曲線。將各組小鼠血清加入待測樣本孔中，依次加入抗CRP-Biotin抗體、酶標試劑、顯色劑和終止液，于酶標儀檢測各孔光密度D(450 nm)值，通過標準曲線方程計算各組小鼠血清CRP水平。

3 結果

3.1 小陷胸湯對HLP小鼠臟器指數的影響與對照組比較，模型組小鼠肝臟指數和脾臟指數顯著升高(均P<0.05)；與模型組比較，低、中、高劑量組和陽性對照組小鼠肝臟指數顯著降低(均P<0.05)，高劑量組和陽性對照組小鼠脾臟指數顯著下降(P<0.05， 表1)。

表1 各組小鼠臟器指數的變化

3.2 小陷胸湯對HLP小鼠血清TC、TG、LDL-C和HDL-C水平的影響與對照組比較，模型組小鼠血清中TC、TG和LDL-C水平顯著升高(均P<0.05)，HDL-C水平顯著降低(P<0.05)；與模型組比較，中、高劑量組和陽性對照組小鼠血清TC、TG、LDL-C水平顯著降低(均P<0.05)，HDL-C水平顯著升高(均P<0.05, 表2)。

表2 各組小鼠血清TC、TG、LDL-C和HDL-C水平的變化

3.3 小陷胸湯對HLP小鼠血清CRP水平的影響與對照組比較，模型組小鼠血清CRP水平顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，低、中、高劑量組和陽性對照組小鼠血清CRP水平顯著降低(均P<0.05, 圖1)。

注：與對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05。圖1 各組小鼠血清CRP水平的變化

3.4 小陷胸湯對HLP小鼠血管組織中CD40+/CD40L+細胞百分比的影響與對照組比較，模型組小鼠血管組織中CD40+/CD40L+細胞百分比顯著上調(P<0.05)；與模型組比較，低、中、高劑量組和陽性對照組小鼠血管組織中CD40+/CD40L+細胞百分比顯著下調(均P<0.05, 圖2)。

注：A. FACS檢測各組小鼠血管組織中CD40+/CD40L+細胞百分比；B. 各組小鼠血管組織中CD40+/CD40L+細胞百分比統計結果。與對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05。圖2 各組小鼠血管組織中CD40+/CD40L+細胞百分比的變化

3.5 小陷胸湯對HLP小鼠脾臟Th1、Th2百分比的影響與對照組比較，模型組小鼠脾臟細胞中Th1百分比顯著增加(P<0.05)，Th2百分比顯著減少(P<0.05)；與模型組比較，低劑量組小鼠脾臟細胞中Th1和Th2百分比差異無統計學意義(均P>0.05)；中、高劑量組和陽性對照組小鼠脾臟細胞中Th1百分比顯著減少(均P<0.05)，Th2百分比顯著增加(均P<0.05， 圖3)。

注：A～B. FACS檢測各組小鼠脾臟細胞中Th1和Th2百分比；C～D. 各組小鼠脾臟中Th1和Th2百分比的統計結果。與對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05。圖3 各組小鼠脾臟細胞中Th1和Th2百分比的比較

4 討論

血脂異常表現為外周血TC、TG、LDL-C等一種或多種指標水平升高，或者HDL-C水平降低[9-10]。LDL-C參與肝臟中TC向肝外轉運的過程，其水平過高會導致TC、TG沉積，堵塞血管[11]。而HDL-C參與將外周組織中的TC轉運至肝臟的分解代謝，能夠減少TC在外周組織血管的沉積，有利于心血管系統健康[12]。CRP是一種典型的急性相血漿蛋白，常作為衡量臨床炎癥反應的非特異性標志物[13]。研究表明，CRP與高血糖、高血脂及多種心血管疾病的發生發展密切相關[14]。本研究采用高脂飼料飼喂小鼠以構建HLP模型，結果顯示，模型組小鼠血清TC、TG和LDL-C水平顯著升高(均P<0.05)，HDL-C水平顯著下降(P<0.05)，符合HLP動物模型評價指標[15]，說明本研究成功構建了HLP小鼠模型。經不同劑量小陷胸湯給藥治療后，HLP小鼠CRP、TC、TG、LDL-C和HDL-C水平得到不同程度改善，其中高劑量組的逆轉效果最為明顯。這提示小陷胸湯能抑制CRP水平，上調HDL-C，加速肝外TC和TG向肝內轉運的代謝，即小陷胸湯具有降低HLP小鼠血脂的功效。

免疫損傷、炎癥反應在HLP及其相關疾病的發病機制中發揮重要作用[16]，因此，調節免疫功能是HLP相關疾病的主要治療策略之一。免疫器官的質量和相關指標是評價機體免疫系統狀態的重要指標。脾臟為體積最大的外周免疫器官，可對血源性抗原產生免疫反應[17]。研究顯示，HLP小鼠脾臟指數降低，機體免疫功能下降[18-19]。肝臟在脂質代謝中發揮關鍵作用，研究發現，改善肝臟脂質代謝和減輕炎癥反應可對高脂飲食誘導的HLP發揮較好的治療效果[20]。CD40/CD40L通路在免疫應答的啟動中發揮重要作用[21]，抑制CD40/CD40L復合物水平可顯著減輕炎癥反應程度[22]。Th1/Th2平衡在免疫調節過程中具有關鍵性作用，根據相關研究結果顯示，調節脾臟Th1/Th2平衡向Th2偏移可發揮炎癥反應抑制作用，從而實現免疫調節[23]。

本研究中，造模后小鼠肝臟指數和脾臟指數均顯著升高，CD40+/CD40L+細胞百分比顯著增加，Th1百分比顯著上升，Th2百分比顯著下降，而中劑量和高劑量小陷胸湯治療HLP小鼠后，臟器指數顯著下降，CD40+/CD40L+細胞百分比顯著減少，Th1百分比顯著下降，Th2百分比顯著上升，提示小陷胸湯能夠改善HLP小鼠臟器，調節機體免疫反應。

綜上所述，小陷胸湯可降低HLP小鼠TC、TG和LDL-C水平，提高HDL-C水平，改善小鼠免疫功能。但是，目前其作用靶點尚不明確，還需進一步利用網絡藥理手段分析其主要活性成分及可能靶點并進行驗證，從而為小陷胸湯的應用推廣提供更多實驗依據。