丙泊酚抑制NF-κB p65的磷酸化緩解葡聚糖硫酸鈉誘導的結腸炎小鼠病理損傷和免疫反應

肖南，唐松江，李曦，何昊穎，代麗娜

(貴州中醫藥大學第一附屬醫院 麻醉科，貴陽 550001)

炎癥性腸病(inflammatory bowel disease，IBD)是以胃腸道慢性炎癥為特征的疾病，包括潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis，UC)和克羅恩病(Crohn's disease，CD)[1]。UC是一種終身疾病，其特征為無癥狀緩解和活動性疾病周期發作，UC患者會出現血便、貧血、腸失禁和體質量減輕的癥狀[2]。當前，UC的治療是使用抗炎劑和免疫調節劑如5-氨基水楊酸、類固醇和硫代嘌呤來鈍化炎性反應并緩解UC進展，但有近一半的患者由于耐藥問題而導致嚴重的不良反應，嚴重者進行了結腸切除術[3]。由于IBD病因復雜，并具有病程長、治愈率低和易復發的特點，迫切需要開發治療IBD的新方法。在動物模型中用于誘導腸道炎癥的2種化學制劑包括2，4，6-三硝基苯磺酸和葡聚糖硫酸鈉(dextran sodium sulfate，DSS)，DSS可以模擬人類UC[4]。

丙泊酚是一種烷基酸類短效靜脈麻醉劑，具有麻醉迅速、穩定及患者術后不良反應發生率低等優點[5]。相關研究發現，丙泊酚還具有免疫調節、抗氧化、抗炎、抗變態反應、保護線粒體等作用[6]。目前，尚未見丙泊酚對IBD是否具有治療作用的報道。本研究探討丙泊酚對DSS誘導的結腸炎小鼠病理損傷和免疫反應的影響，旨在為IBD的治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 實驗動物50只C57BL/6雄性小鼠，由成都達碩實驗動物有限公司提供，8周齡，體質量(22±2)g，許可證號為SCXK(川)2015-030。所有小鼠飼養于貴州中醫藥大學實驗動物中心，自然光照，常規飼養7 d。

1.2 試驗藥物與主要試劑丙泊酚(100806-201803)購自中國食品藥品檢定研究院，化學式C12H18O，相對分子質量178.27，純度≥99.9%；H-E染液(D006-1-1)及IL-1β(H002)、TNF-α(H052)、IL-6(H007)、IL-10(H009)測試盒購自南京建成生物工程研究所；末端脫氧核苷酸轉移酶介導的dUTP缺口末端標記(terminal dexynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick-end labeling，TUNEL)細胞凋亡檢測試劑盒(C1091)、二喹啉甲酸(bicinchonininc acid，BCA)蛋白濃度測定試劑盒(P0012)購自上海碧云天生物技術有限公司；p65(ab16502)、β-actin(ab8227)購自Abcam公司。

1.3 方法

1.3.1 動物處理及分組 參照參考文獻[7]中的方法，將小鼠隨機分為5組：對照組、模型組、丙泊酚低劑量組、丙泊酚中劑量組和丙泊酚高劑量組。除對照組外其余各組小鼠給予3%DSS溶液自由飲用，連續7 d，建立結腸炎小鼠模型。丙泊酚低、中、高劑量組分別腹腔注射丙泊酚30、75、150 mg/kg[8]，對照組和模型組腹腔注射等量生理鹽水。

1.3.2 疾病活動指數評分 參照參考文獻[9]中的方法，基于體質量丟失、糞便完整性和直腸出血3項指標對各組小鼠疾病活動指數進行評分。

1.3.3 H-E染色 采用H-E染液將石蠟切片脫蠟，蒸餾水潤濕組織，核染液染色5 min，水洗5 s，漿染液染色30 s，水洗后用濾紙吸干，無水乙醇脫水2次后封片，在熒光顯微鏡下觀測，并參照參考文獻[10]中的方法進行組織病理學評分。

1.3.4 TUNEL染色 將各組小鼠結腸組織切片用二甲苯浸洗2次脫蠟(5 min/次)，梯度乙醇脫水。用蛋白酶K工作液在37 ℃下封閉20 min，PBS清洗2次。在每個切片樣本上加入50 μL TUNEL反應液，37 ℃避光反應60 min。用4'，6-二脒基-2-苯基吲哚(4'，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)復染10 min后于熒光顯微鏡下觀察。

1.3.5 qRT-PCR 取各組小鼠結腸組織，按照總RNA提取試劑盒說明書步驟抽提各待測樣本的總RNA，將總RNA反轉錄為cDNA，用qRT-PCR試劑盒進行定量檢測。反應條件為：95 ℃ 3 min； 95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，40 個循環。用2-ΔΔCt法計算基因的表達水平。

1.3.6 ELISA 取各組小鼠結腸組織，PBS沖洗后剪碎，在冰上用勻漿器制成勻漿，用BCA試劑盒提取總蛋白并測定蛋白質含量后再參照ELISA試劑盒說明書檢測IL-6、IL-10水平。

1.3.7 Western blotting 采用Western blotting檢測p65、p-p65的蛋白表達。取各組小鼠結腸組織，用BCA試劑盒提取總蛋白并測定蛋白質含量。提取等量蛋白質樣本，以100 ℃變性5 min，用SDS-PAGE分離并轉移至PVDF膜，在4 ℃下加入相應一抗并孵育過夜，清洗后在4 ℃下加入辣根過氧化物酶標記的二抗孵育2 h，最后加入發光液曝光處理。用ImageJ軟件對條帶進行定量分析，統計各條帶灰度值。

2 結果

2.1 丙泊酚對DSS誘導的結腸炎小鼠模型體質量和結腸長度的影響與對照組比較，模型組小鼠體質量顯著降低(P<0.05)；與模型組比較，丙泊酚中、高劑量組小鼠體質量顯著升高(P<0.05，圖1A)。與對照組比較，模型組小鼠結腸長度顯著縮短(P<0.05)；與模型組比較，丙泊酚中、高劑量組小鼠結腸長度顯著增加(P<0.05，圖1B)。

注：A. 丙泊酚對DSS誘導的結腸炎小鼠模型體質量的影響；B. 丙泊酚對DSS誘導的結腸炎小鼠模型結腸長度的影響。與對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05。圖1 丙泊酚對DSS誘導的結腸炎小鼠模型體質量和結腸長度的影響

2.2 丙泊酚對DSS誘導的結腸炎小鼠模型結腸病理損傷的影響與對照組比較，模型組小鼠結腸組織病理學評分顯著升高(P<0.05)。與模型組比較，丙泊酚中、高劑量組小鼠結腸組織病理學評分顯著降低(P<0.05)。詳見圖2。

注：A.H-E染色檢測小鼠結腸組織病理損傷(×200)；B.各組小鼠結腸組織病理學評分的比較。與對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05。圖2 丙泊酚對DSS誘導的結腸炎小鼠模型結腸病理損傷的影響

2.3 丙泊酚對DSS誘導的結腸炎小鼠模型結腸細胞凋亡的影響與對照組比較，模型組小鼠結腸細胞凋亡率顯著增加(P<0.05)。與模型組比較，丙泊酚中、高劑量組小鼠結腸細胞凋亡率顯著降低(P<0.05)。詳見圖3。

注：A. TUNEL染色檢測小鼠結腸細胞凋亡情況(×200)；B.各組小鼠結腸細胞凋亡率的比較。與對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05。圖3 丙泊酚對DSS誘導的結腸炎小鼠模型結腸細胞凋亡的影響

2.4 丙泊酚對DSS誘導的結腸炎小鼠模型IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-10mRNA和蛋白表達的影響與對照組比較，模型組小鼠IL-1β、IL-6、TNF-αmRNA水平顯著升高(P<0.05)，IL-10 mRNA水平顯著降低(P<0.05)；與模型組比較，丙泊酚中、高劑量組小鼠IL-1β、IL-6、TNF-αmRNA水平顯著降低(P<0.05)，IL-10 mRNA水平顯著升高(P<0.05)。與對照組比較，模型組小鼠IL-1β、IL-6、TNF-α水平顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，丙泊酚中、高劑量組小鼠IL-1β、IL-6、TNF-α水平顯著降低(P<0.05)，IL-10水平顯著升高(P<0.05)。詳見圖4。

注：A.各組小鼠IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-10 mRNA水平的比較；B. 各組小鼠IL-1β水平的比較；C. 各組小鼠IL-6水平的比較；D.各組小鼠TNF-α水平的比較；E.各組小鼠IL-10水平的比較。與對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05。圖4 丙泊酚對DSS誘導的結腸炎小鼠模型IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-10 mRNA和蛋白水平的影響

2.5 丙泊酚對DSS誘導的結腸炎小鼠模型p-p65/p65比值的影響與對照組比較，模型組小鼠p-p65/p65比值顯著升高(P<0.05)。與模型組比較，丙泊酚中、高劑量組小鼠p-p65/p65比值顯著降低(P<0.05)。詳見圖5。

注：A. Western blotting檢測小鼠p65、p-p65蛋白的表達；B. 各組小鼠p-p65/p65比值的比較。與對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05。圖5 丙泊酚對DSS誘導的結腸炎小鼠模型p-p65/p65比值的影響

3 討論

相關研究發現，IBD的患病率不斷增長，但目前尚無特效的治療藥物。體質量變化是反映IBD患者病情發展和腸道功能最直接的指標，結腸長度的變化在一定程度上可以反映炎癥進展的程度。本研究通過建立DSS誘導的結腸炎小鼠模型，對小鼠的結腸長度、體質量變化和結腸組織病理損傷進行檢測，并用丙泊酚進行治療。結果顯示，丙泊酚對DSS誘導的結腸炎小鼠模型具有一定的治療作用。

腸黏膜上皮是腸道的重要防御屏障，在抵擋腸道有害病菌和毒物入侵中發揮重要作用。當IBD發病時，大量的腸黏膜上皮細胞發生凋亡，導致腸黏膜通透性增加，抑制腸上皮細胞凋亡，能顯著改善腸黏膜屏障功能[11]。本研究發現，丙泊酚具有抑制DSS誘導的結腸炎小鼠模型結腸細胞凋亡的作用，提示丙泊酚可通過減少腸黏膜上皮細胞凋亡，改善DSS誘導的結腸黏膜損傷。

腸道炎癥是IBD的主要特征，控制炎癥反應是治療IBD的重要方法。IL-1β是IBD較重要的促炎因子之一，位于炎癥反應的上游，可促進IL-6、TNF-α的分泌，并正反饋自身分泌IL-1β[12]。TNF-α由活化的巨噬細胞產生，可介導中性粒細胞、淋巴細胞及單核巨噬細胞等與血管內皮細胞黏附，進而使細胞遷移和外滲至局部組織，引起炎癥反應[13]。黃盈瑜等[14]研究發現，抗TNF-α治療可減輕炎癥并顯著抑制DSS誘導的結腸炎引起的腸黏膜通透性增加。IL-6可促進腸道上皮細胞的增殖和分化，在IBD引起的潰瘍中，IL-6有利于潰瘍黏膜愈合[15]。IL-10具有加強黏膜屏障的功能，與黏膜屏障信號標志分子的變化相一致[16]。本研究發現，丙泊酚具有降低DSS誘導的結腸炎小鼠模型IL-1β、IL-6、TNF-αmRNA和蛋白水平，升高IL-10 mRNA和蛋白水平的作用，提示丙泊酚可通過抑制炎癥反應改善結腸炎癥。

免疫反應異常是造成IBD炎癥和組織損傷的重要因素[17]。NF-κB是一種可特異性結合多種基因啟動子并促進轉錄的蛋白質，NF-κB參與基因表達的調控，尤其是與免疫和炎癥反應相關的基因。NF-κB影響炎癥反應的進程，在細胞生長、病毒感染和某些疾病急性期反應中起重要作用[18]。Zhang等[8]研究發現，丙泊酚可通過抑制NF-κB p65的活化改善卵清蛋白誘發的過敏性哮喘小鼠的氣道炎癥。遲宏罡等[19]研究發現，黃芩湯可通過抑制NF-κB p65活化對DSS誘導的結腸炎小鼠模型起保護作用。本研究發現，丙泊酚具有降低DSS誘導的結腸炎小鼠模型p-p65/p65比值的作用，提示丙泊酚可通過調控p65的表達影響細胞因子，從而對DSS誘導的結腸炎小鼠模型具有治療作用。

綜上所述，丙泊酚可能通過抑制NF-κB p65的磷酸化，緩解DSS誘導的結腸炎小鼠病理損傷，減少炎性因子的釋放，抑制結腸細胞凋亡，從而對結腸炎起到治療作用。但丙泊酚對治療結腸炎的適宜劑量還有待進一步研究。本研究為丙泊酚臨床治療IBD的開發和利用提供了理論基礎。

(致謝：本課題在研究過程中，得到了貴州中醫藥大學藥學院實驗室的支持，得到了周俊老師的熱忱指導和無私幫助，特向老師致以深深的敬意并表達最誠摯的謝意！)