PM2.5抑制PHA誘導的人外周血T細胞轉化作用

李衛霞， 劉曉霞， 陳劍華 ，郭旭麗 ，王雪玲 ，霍忠超

(1. 河北工程大學醫學院 免疫教研室，邯鄲 056038； 2. 河北工程大學附屬醫院 腫瘤科，邯鄲 056038)

大氣污染物中直徑≤2.5 μm的細顆粒物(diameter≤2.5 μm particular matter, PM2.5)粒徑小、表面積大、吸附能力強，易于吸附重金屬、細菌、病毒等有害物質，具有較強的致病性[1]。流行病學調查顯示，PM2.5與人體各系統如呼吸系統、心血管系統、免疫系統等疾病的發生發展密切相關[2-5]。研究表明，PM2.5暴露能導致肺部氧化應激性損傷，促進上皮細胞分泌炎性因子，加重炎癥反應[6]。此外，PM2.5還可影響免疫系統功能，使機體的抗感染能力降低，但PM2.5對人T細胞轉化功能的影響和具體機制尚不明確。研究用植物凝集素(phytohemagglutin，PHA)刺激人外周血T細胞轉化，同時加入不同濃度PM2.5共培養，觀察PM2.5染毒對人T細胞轉化功能的影響及其可能作用機制。

1 材料與試劑

1.1 外周血樣本的采集采集12例健康男性志愿者外周血(均為河北工程大學醫學院青年教師及學生志愿者)，年齡20～40歲，無急、慢性疾病、免疫相關疾病史，近期無服藥史。

1.2 試劑與儀器人外周血淋巴細胞分離液，購自北京索萊寶科技有限公司；RPMI 1640細胞培養液，購自Gibco公司；PHA，購自Sigma-Aldrich公司；活性氧類(reactive oxygen species，ROS)檢測試劑盒，購自南京建成生物工程研究所；8-OHdG檢測試劑盒，購自武漢華美生物工程有限公司；CCK-8檢測試劑盒，購自碧云天生物技術研究所；IL-6和TNF-α ELISA檢測試劑盒，購自Abcam公司。石英纖維濾膜，購自頗爾(中國)有限公司；VFC-PM2.5型大流量采樣器，來自Thermo Fisher Scientific公司；F-2700熒光分光光度計，來自日立(中國)有限公司；iMark酶標儀，來自Bio-Rad公司。

2 方法

2.1 PM 2.5的采集及樣本的制備采樣地點位于河北省邯鄲市河北工程大學能環實驗樓4層平臺(北緯36°3'，東經114°2')，距地面高度約10 m，東、南兩面緊鄰2條城市主要交通干道，西、北側分別為教學樓、學生宿舍及住宅區，采樣點周圍5 km范圍內無大型工業污染源。采樣時間為冬季早8：00至次日7：30，采樣時長24 h。將載有PM2.5的濾膜浸入雙蒸水，超聲振蕩3次，30 min/次，真空冷凍干燥，-20 ℃低溫冰箱保存備用。

PM2.5懸液的制備：用PBS將PM2.5顆粒物制備成1 mg/mL儲備液，超聲振蕩20 min，高壓滅菌，4 ℃保存備用。

2.2 外周血淋巴細胞的分離和培養采集12例健康志愿者空腹靜脈血，3 mL/例，肝素抗凝。用等體積PBS稀釋抗凝血，緩慢加入6 mL淋巴細胞分離液，400×g離心20 min，吸取淋巴細胞層；PBS漂洗2次，400×g離心10 min，棄上清液，加入含10% FBS的RPMI 1640培養液，配制成1×106個/mL單細胞懸液；分別接種細胞懸液于96、48孔板，參考馮欲靜等[7]方法每孔分別加入終濃度為0、30、100、300 μg/mL的PM2.5懸液及10 μg/mL PHA，混勻，于37 ℃、5% CO2條件下培養24、48和72 h。

2.3 CCK-8法檢測T細胞增殖抑制率用96孔板培養細胞，于PM2.5作用時間結束時根據CCK-8檢測試劑盒說明書，每孔加入CCK-8溶液10 μL，混勻后37 ℃孵育2 h。于酶標儀測定光密度[D(450 nm)]值，并按以下公式計算相應參數：

細胞的增殖抑制率=[1-(實驗組D值-空白組D值)/(對照組D值-空白組D值)]×100%

細胞轉化值=實驗組平均D值-對照組平均D值[8]

對照組及空白組(non-treatment control, NC)均不含PM2.5或細胞成分。

2.4 ELISA檢測細胞培養上清液TNF-α、IL-6和8-OHdG水平用48孔板培養細胞，加入不同濃度PM2.5染毒72 h，收集細胞培養上清液，根據TNF-α、IL-6和8-OHdG檢測試劑盒說明書檢測培養上清液中炎性因子表達和DNA損傷情況。

2.5 熒光分光光度法檢測T細胞內ROS水平熒光探針DCFH-DA進入細胞后可被細胞內的脂肪酶水解生成DCFH，細胞內的ROS能將不帶熒光的DCFH氧化生成帶熒光的DCF，利用熒光分光光度法檢測生成DCF的熒光強度，測得細胞內ROS水平。具體為用48孔板培養細胞，PM2.5染毒72 h后，加入10 μmol/L DCFH-DA，37 ℃避光孵育30 min；收集細胞，PBS漂洗2次，200×g離心10 min，收集細胞制成1 mL懸液, 密度1×106個/mL；熒光分光光度儀檢測激發波長488 nm、發射波長525 nm處平均熒光強度。

3 結果

3.1 PM2.5抑制T細胞增殖T細胞受絲裂原刺激后可被活化，進而轉化為體積較大、代謝能力旺盛的淋巴母細胞，并發生一系列的增殖反應，稱為淋巴細胞的轉化，細胞轉化值的高低一定程度上可以反映其免疫功能[9]。本研究用PHA刺激24、48和72 h誘導T細胞轉化，檢測PM2.5對T細胞增殖的抑制作用。結果顯示，在PM2.5染毒時間相同時，隨著PM2.5劑量的增加，T細胞的增殖抑制率逐漸升高，轉化值逐漸降低；100 μg/mL PM2.5對T細胞的增殖抑制率顯著高于30 μg/mL組(均P<0.01)且轉化值顯著低于0 μg/mL組(均P<0.05)；300 μg/mL PM2.5對T細胞的增殖抑制率顯著高于100 μg/mL組，且轉化值顯著低于100 μg/mL組(均P<0.05)；PM2.5染毒劑量相同時，隨著染毒時間的延長，T細胞的增殖抑制率和轉化值均升高，100 μg/mL PM2.5染毒48 h時T細胞的增殖抑制率顯著高于24 h組(P<0.01)；300 μg/mL PM2.5染毒72 h時T細胞的增殖抑制率顯著高于48 h組，轉化值顯著高于24 h組(均P<0.05)(圖1、表1)。以上提示，PM2.5能顯著抑制PHA誘導的T細胞增殖和轉化，且抑制率的高低與PM2.5染毒劑量和時間有顯著關聯。

注：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。圖1 不同劑量PM2.5對PHA作用下T細胞增殖的抑制作用

表1 不同劑量PM2.5對PHA作用下T細胞轉化值的影響

3.2 PM2.5誘導T細胞分泌細胞因子PM2.5染毒24、48、72 h時，收集細胞培養上清液，ELISA檢測促炎細胞因子水平。結果顯示，隨著PM2.5劑量的增加，細胞分泌IL-6、TNF-α的水平逐漸上升；染毒24 h時，300 μg/mL組PM2.5染毒細胞分泌IL-6的水平顯著高于100 μg/mL組(P<0.05)，100、300 μg/mL組PM2.5染毒細胞分泌TNF-α的水平均顯著高于30 μg/mL組(均P<0.05)；染毒48、72 h時，300 μg/mL組PM2.5染毒細胞分泌IL-6的水平顯著高于100 μg/mL組(均P<0.01)， 且100 μg/mL組高于30 μg/mL組(均P<0.05)；而染毒48、72 h條件下，300、100 μg/mL組細胞分泌TNF-α的水平顯著高于30 μg/mL組(均P<0.05)，且300 μg/mL組PM2.5染毒細胞72 h時IL-6的水平顯著高于同等劑量下48 h組，TNF-α的水平顯著高于同等劑量下24 h組(有P<0.05)(圖2)。由此，PM2.5能顯著刺激PHA誘導的T細胞分泌IL-6和TNF-α，且分泌水平與PM2.5染毒時間及劑量的高低有關。

注：*P<0.05，**P<0.01。圖2 不同劑量PM2.5對PHA作用下T細胞細胞因子分泌的影響

3.3 PM2.5致T細胞DNA損傷產生8-OHdG在PHA刺激外周血T細胞24、48和72 h時，檢測PM2.5對T細胞DNA損傷的影響。結果顯示，隨著PM2.5劑量的增加，細胞培養上清液中8-OHdG水平顯著上升(均P<0.05)；PM2.5染毒細胞時間相同時，100 μg/mL組細胞上清液中8-OHdG水平顯著高于30 μg/mL組，300 μg/mL組顯著高于100 μg/mL組(均P<0.05)；染毒48和72 h時，空白組上清液中8-OHdG水平顯著高于100 μg/mL組(均P<0.05)，但與300 μg/mL組相比無顯著差異(均P>0.05)(圖3)。由此，PM2.5能顯著促進PHA誘導下T細胞8-OHdG產生，且8-OHdG水平與PM2.5水平呈顯著劑量依賴性。

注：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。圖3 不同劑量PM2.5對PHA作用下T細胞8-OHdG水平的影響

3.4 PM2.5誘導T細胞產生ROS在外周血T細胞受PHA刺激24、48和72 h時，檢測PM2.5染毒T細胞ROS的產生。結果顯示，隨著PM2.5劑量的增加，細胞培養上清液中ROS含量顯著上升，其中PM2.5濃度為30 μg/mL時，上清液中ROS水平顯著高于0 μg/mL組(48、72 h，均P<0.05)；PM2.5為100、300 μg/mL時，上清液中ROS水平均顯著高于30 μg/mL組(24、48和72 h，均P<0.05)(圖4)。由此，PM2.5能顯著增加PHA作用下T細胞ROS的產生，且與PM2.5水平呈顯著劑量依賴性。

注：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。圖4 不同劑量PM2.5對PHA作用下T細胞ROS水平的影響

4 討論

PM2.5作為大氣中的重要污染物，具有很強的吸附能力，可攜帶多種有毒有害物質透過肺間質進入呼吸以及淋巴系統，進而對免疫系統產生不良影響[10]。外周血T細胞是參與機體適應性免疫應答的重要組成部分，其數量和功能異常將嚴重影響人體免疫系統的功能。

通過PM2.5暴露誘導機體產生細胞生物學反應，包括細胞毒作用、炎癥反應、氧化應激反應等，可以評估PM2.5對人體健康的影響[11]。馮欲靜等[7]用不同劑量PM2.5染毒人外周血淋巴細胞，結果顯示PM2.5可顯著誘導其凋亡，且細胞凋亡率與染毒時間及PM2.5劑量有關。本研究通過于體外PHA刺激人外周血T細胞轉化實驗中加入不同劑量PM2.5共孵育，發現PM2.5能抑制PHA誘導的T細胞增殖，且抑制率的高低與PM2.5劑量以及染毒時間顯著關聯。同樣，Olufunmilola等[12]用PM2.5染毒人外周血淋巴細胞20 h后，再加入結核菌素刺激5 h，結果顯示PM2.5暴露抑制了人外周血CD3+T細胞表面CD69分子的表達，阻礙了結核桿菌誘導的早期T細胞活化，該結果進一步證明PM2.5能抑制人外周血T細胞轉化，影響機體細胞免疫應答水平。

研究發現，PM2.5的短期暴露可引起多種免疫細胞和組織炎癥反應、免疫毒性反應，進而引發不同的肺部疾病[13-14]。Ma等[15]通過體外研究證明經PM2.5處理的巨噬細胞可顯著上調CD4+和CD8+T細胞IFN-γ、IL-10、IL-17和IL-21水平，且經PM2.5刺激的CD4+和CD8+T細胞可誘導人支氣管上皮細胞死亡，表明PM2.5可促進巨噬細胞依賴性T細胞介導的炎癥反應。本研究同樣發現，PM2.5染毒48、72 h可顯著促進PHA誘導的T細胞分泌IL-6、TNF-α等炎性因子，且分泌水平與PM2.5有顯著的劑量依賴關系。Lu等[16-17]通過體內、外研究亦發現PM2.5能誘導PBMC釋放炎性因子，誘導Th2型分化，導致Th2型細胞因子和ILC2相關轉錄因子水平顯著升高，肺組織出現炎癥細胞浸潤。本結果進一步證明PM2.5在誘導Th2型炎性因子產生、促進炎癥反應方面作用顯著。此外，本研究發現，PM2.5僅在較高濃度時(100、300 μg/mL)對T細胞免疫功能有顯著影響，該作用濃度遠高于嚴重污染條件下空氣中PM2.5含量[空氣質量指數(air quality index， AQI)>300，PM2.5>250 μg/m3][18]，這也是目前研究PM2.5對機體影響時普遍存在的問題，在較低濃度下通過延長染毒時間能否增加PM2.5對T細胞功能的影響仍需進一步研究。

Liu等[19]通過PM2.5染毒豬肺泡巨噬細胞3D4/21，結果發現PM2.5可通過激活TLR4/MyD88通路誘導ROS生成和炎性因子IL-1β、IL-18、TNF-α的釋放進而導致細胞死亡。Yang等[20]的研究同樣提示PM2.5通過誘導過量ROS的產生導致線粒體膜完整性受損，從而降低A549細胞的活性。本研究在PM2.5染毒PHA誘導人外周血T細胞轉化過程中同樣發現，PM2.5能促進淋巴細胞釋放ROS，導致DNA損傷并產生過量8-OHdG，進而抑制PHA誘導的T細胞轉化。

綜上所述，PM2.5通過促進淋巴細胞釋放ROS導致DNA損傷，從而抑制PHA誘導的T細胞轉化，并促進炎癥反應的發生，本結果為PM2.5誘導T細胞免疫毒性反應的產生提供了實驗依據。但PM2.5成分復雜，且因季節和采樣地的不同差異較大，本研究中PM2.5的主要組分及其誘發T細胞免疫毒性反應的分子機制尚不明確，且PM2.5對T細胞亞群及功能的影響仍需進一步研究。