血紅素加氧酶1對哮喘小鼠Th1/Th2比值及ILC2的調(diào)節(jié)作用

武玉姣，張夢，俞倩穎，周瑤，夏振煒

(上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院 兒內(nèi)科，上海 200025)

支氣管哮喘(下文簡稱哮喘)是一種慢性氣道炎癥性疾病，由固有免疫和適應(yīng)性免疫細胞共同參與，引起氣道炎癥細胞浸潤，氣道反應(yīng)性增高，黏液分泌過度，最終導(dǎo)致氣道狹窄和重塑[1]。哮喘的臨床表現(xiàn)主要為反復(fù)發(fā)作的咳嗽、喘息、胸悶等，嚴重者可因呼吸困難危及生命。哮喘的發(fā)病機制復(fù)雜，由遺傳和環(huán)境等多因素引起的氣道免疫調(diào)節(jié)異常所致。既往觀點認為，Th2型免疫應(yīng)答過度導(dǎo)致Th1/Th2免疫失衡是引起哮喘氣道炎癥的主要原因，近些年研究發(fā)現(xiàn)ILC2等也參與哮喘疾病的病理生理過程[2]。ILC2可產(chǎn)生Th2型細胞因子IL-4、IL-5和IL-13，促進過敏性哮喘的發(fā)生發(fā)展，并能夠通過細胞接觸依賴的方式調(diào)節(jié)未致敏T細胞，促進其定向分化為Th2，從而抑制其向Th1分化[3]。有研究指出，在缺乏T、B細胞的情況下，ILC2也可誘導(dǎo)哮喘氣道炎癥反應(yīng)，表明ILC2在哮喘發(fā)生發(fā)展過程中亦發(fā)揮關(guān)鍵作用[4]。因此，調(diào)節(jié)ILC2水平對于控制哮喘氣道炎癥反應(yīng)同樣重要。

血紅素加氧酶(heme oxygenase，HO)是一種細胞內(nèi)限速酶，可以將血紅素降解為膽綠素、游離二價鐵離子和CO，其有3種亞型：HO-1、HO-2和HO-3[5]。其中，HO-1是一種保護性蛋白，具有抗氧化應(yīng)激、抑炎、抗平滑肌增生及調(diào)節(jié)細胞周期等重要功能[6-7]。研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)氯化高鐵血紅素(hemin)上調(diào)HO-1表達后可減輕卵清蛋白(ovalbumin， OVA)誘發(fā)的過敏性哮喘小鼠模型氣道炎癥反應(yīng)[8-9]。本研究選用屋塵螨(house dust mite，HDM)，一種存在于環(huán)境中的重要病原體(是目前最常見的哮喘過敏原)以致敏、激發(fā)、構(gòu)建過敏性哮喘小鼠模型。并且，經(jīng)hemin干預(yù)誘導(dǎo)HO-1高表達，分析Th1/Th2比值及肺臟ILC2百分比，從而初步探討HO-1拮抗HDM誘發(fā)的小鼠過敏性哮喘氣道炎癥及對Th1/Th2比值、ILC2百分比的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 健康雌性C57BL/6小鼠，體質(zhì)量(18±2) g，6～8周齡，30只，購自上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司，飼養(yǎng)于上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院動物實驗醫(yī)學(xué)研究中心。

1.1.2 實驗試劑 FACS相關(guān)實驗試劑和抗體(亞美尼亞倉鼠抗小鼠)： Lineage(CD3、Gr-1、CD11b、CD45R、Ter-119)-FITC、CD11c-APC、Ly6G-FITC、CD4-BV450、IL-4-FITC和IFN-γ-APC，購自BioLegend公司；抗CD90.2-PE-Cy7、GATA3-BV421、RORγt-AF647、Siglec-F-PE、CD11b-PE-Cy7和CD45-APC-Cy7抗體，購自BD公司；破膜固定液、Foxp3/轉(zhuǎn)錄因子染色液，購自Thermo Fisher Scientific公司；IFN-γ、IL-4、IL-5和IL-13檢測試劑盒，購自BioLegend公司；兔抗鼠HO-1抗體，購自CST公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 小鼠過敏性哮喘模型的建立 小鼠過敏性哮喘模型的致敏、激發(fā)方法參照文獻[10](n=5)。吸入異氟烷麻醉小鼠后，于第0天(Day 0， D0， 后類推)鼻滴50 μL含100 μg HDM的PBS致敏；于D7～D11連續(xù)每天鼻滴50 μL含10 μg HDM的PBS激發(fā)，建立HDM所致過敏性哮喘小鼠模型(HDM組)。對照組以等量PBS代替HDM混懸液滴鼻(CON組)。HDM + hemin組經(jīng)等量HDM處理，于-D2、-D1和D5、D6給予每只小鼠腹腔注射75 μmol/kg hemin。各組小鼠均于D14異氟烷麻醉后被處死并取材研究。

1.2.2 小鼠肺臟組織病理學(xué)觀察 取1.2.1小鼠右下肺組織，PBS漂洗后置于4%多聚甲醛中固定，常規(guī)石蠟包埋切片，H-E及PAS染色后鏡檢。

1.2.3 Western blotting檢測小鼠肺臟組織HO-1的表達水平 取1.2.1小鼠右上肺組織，加入1 mL預(yù)冷的含蛋白酶和磷酸酶抑制劑的RIPA，60 Hz勻漿60 s后于冰上靜置1 h；4 ℃、12 000×g離心15 min，收集上清液，BCA試劑盒定量蛋白并調(diào)整其濃度。80 V蛋白電泳30 min，120 V電泳60 min；300 mA轉(zhuǎn)膜1 h后，將PVDF膜置于封閉液(含5%脫脂牛奶的TBST)中室溫封閉1 h。以封閉液按1∶1 000稀釋兔抗鼠HO-1抗體，4 ℃孵育PVDF膜過夜。1×TBST洗膜后加入用相同溶液按1∶5 000稀釋的二抗，室溫孵育1 h。1×TBST洗膜后ECL顯色。

1.2.4 FACS檢測小鼠支氣管肺泡灌洗液(broncho-alveolar lavage fluid，BALF)中嗜酸性粒細胞(eosinophil，EOS)和中性粒細胞(neutrophil，NEU)百分比 異氟烷麻醉后頸椎脫臼處死小鼠(n=5)，取仰臥位鋪于解剖板上，剪開小鼠頸部皮膚暴露氣管，將22 G導(dǎo)管針插入氣管，注入預(yù)冷PBS灌洗3次，0.6 mL/次。收集BALF，4 ℃、460×g離心6 min后收集細胞沉淀，加入抗CD11c-APC、Ly6G-FITC、Siglec-F-PE、CD11b-PE-Cy7和CD45-APC-Cy7抗體，4 ℃避光孵育45 min，后使用FACS液漂洗并進行相關(guān)檢測。

1.2.5 ELISA檢測小鼠肺臟組織炎性因子表達水平 取1.2.1小鼠左肺葉，預(yù)冷PBS漂洗1次，洗去紅細胞；加入含0.05% Triton X-100及蛋白酶和磷酸酶抑制劑混合物的PBS 800 μL，組織勻漿器60 Hz勻漿60 s；冰上靜置1 h后，4 ℃、12 000×g離心15 min，收集上清液。按ELISA試劑盒說明書檢測上清液中炎性因子水平。

1.2.6 FACS檢測小鼠肺臟組織Th1/Th2比值和ILC2百分比 于超凈工作臺剪碎肺臟組織(取材自1.2.4小鼠)，置于5 mL無菌離心管中，加入3 mL無菌膠原酶，于37 ℃水浴鍋消化30 min，經(jīng)70 μm尼龍篩過濾后得到肺單細胞懸液。將細胞接種于24孔培養(yǎng)板，1 mL/孔，加入50 ng/mL 佛波酯(phorbol ester, PMA)和1 μg/mL離子霉素，同時加入1∶1 000稀釋的布雷非德菌素A(brefeldin A, BFA)以阻斷細胞因子胞外分泌。于37 ℃、5% CO2、95%濕度條件細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h后收集細胞。加入抗表面標志物抗體抗CD4-BV450 4 ℃染色45 min，F(xiàn)ACS液漂洗2次；加入100 μL破膜固定液，室溫避光孵育60 min，破膜緩沖液漂洗2次；加入抗胞內(nèi)細胞因子抗體(抗IFN-γ-APC、IL-4-FITC)4 ℃染色60 min，破膜緩沖液漂洗2次，加入適量FACS液，流式細胞儀檢測Th1、Th2百分比。

同樣，肺部灌洗后經(jīng)氣管注入1 mL膠原酶，將充滿膠原酶的肺組織置于2 mL含膠原酶的消化液中，37 ℃消化30 min，經(jīng)70 μm尼龍篩過濾后得到肺單細胞懸液。依據(jù)細胞計數(shù)結(jié)果取適量體積單細胞懸液重懸于FACS液，加入抗表面標志物抗體抗Lineage-FITC、CD90.2-PE-Cy7抗體，4 ℃染色45 min，F(xiàn)ACS液漂洗2次；用Foxp3/轉(zhuǎn)錄因子破膜固定液4 ℃避光孵育60 min，破膜緩沖液漂洗2次；加入抗核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子抗體(抗GATA3-BV421、RORγt-AF647抗體)4 ℃染色60 min；破膜緩沖液漂洗2次，加入適量FACS液，流式細胞儀檢測ILC2百分比。

2 結(jié)果

2.1 小鼠肺臟組織HO-1蛋白表達量變化Wes-tern blotting檢測小鼠肺臟組織HO-1蛋白表達量。結(jié)果顯示，HDM組HO-1蛋白表達量較CON組顯著增高(P<0.05)，而hemin干預(yù)后，蛋白表達量再顯著增加(P<0.005)(圖1)。

注：A. Western blotting檢測小鼠肺臟組織中HO-1蛋白表達量；B. 不同組別小鼠肺臟組織中HO-1蛋白表達量統(tǒng)計圖。*P<0.05，**P<0.005。圖1 不同組別小鼠肺臟組織中HO-1蛋白表達量變化比較

2.2 造模小鼠肺臟組織病理學(xué)變化H-E和PAS染色結(jié)果顯示，HDM組小鼠氣道內(nèi)存在較多炎癥細胞浸潤，氣道分泌物增加，hemin干預(yù)后炎癥反應(yīng)明顯減輕，CON組未見明顯炎癥反應(yīng)(圖2)。

圖2 不同組別小鼠肺臟的組織病理學(xué)分析(400×)

2.3 小鼠BALF中EOS和NEU百分比變化FACS檢測BALF中EOS(CD45+Siglec-F+CD11c-)及NEU(CD45+Ly6G+CD11b+)百分比。結(jié)果顯示，HDM組BALF中EOS及NEU百分比較CON組顯著增加，以前者為主；hemin干預(yù)后，與HDM組相比，EOS、NEU百分比顯著降低(有P<0.05、P<0.005，圖3)。

注：A. FACS分析BALF中EOS(CD45+Siglec-F+CD11c-)百分比變化；B. FACS分析BALF中NEU(CD45+Ly6G+CD11b+)百分比變化；C. BALF中EOS百分比變化統(tǒng)計結(jié)果；D. BALF中NEU百分比變化統(tǒng)計結(jié)果。*P<0.05，**P<0.005。圖3 不同組別小鼠BALF中EOS及NEU百分比比較

2.4 小鼠肺臟組織中Th1、Th2相關(guān)細胞因子表達水平變化ELISA檢測小鼠肺臟組織中Th1型細胞因子(IFN-γ)及Th2型細胞因子(IL-4、IL-5、IL-13)表達水平。結(jié)果顯示，與CON組相比，HDM組IFN-γ水平無顯著差異(P>0.05)，IL-4、IL-5、IL-13水平顯著升高(均P<0.000 1)；hemin干預(yù)后，與HDM組相比，IFN-γ水平無顯著變化(P>0.05)，但IL-4、IL-5、IL-13水平顯著降低(P<0.000 1、P<0.005、P<0.05)(圖4)。

注：A. ELISA檢測不同組別小鼠肺臟組織中IFN-γ水平；B. ELISA檢測不同組別小鼠肺臟組織中IL-4水平；C. ELISA檢測不同組別小鼠肺臟組織中IL-5水平；D. ELISA檢測不同組別小鼠肺臟組織中IL-13水平。*P<0.05，**P<0.005，***P<0.000 1。圖4 不同組別小鼠肺臟組織中Th1、Th2型細胞因子表達水平變化比較

2.5 小鼠肺臟組織Th1/Th2比值變化FACS分析小鼠肺臟組織中Th1/Th2比值變化。結(jié)果顯示，HDM組Th1(CD4+IFN-γ+T)百分比與對照組相比有下降趨勢，而hemin干預(yù)后有所上升，但差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)；HDM組Th2(CD4+IL-4+T)百分比較對照組顯著增加，在hemin干預(yù)后顯著下降(均P<0.005)。HDM組Th1/Th2比值顯著降低，同樣hemin干預(yù)后較HDM組比值顯著增加(P<0.000 1、P<0.05)。詳見圖5。

注：A. FACS分析小鼠肺臟Th1(CD4+IFN-γ+T)、Th2(CD4+IL-4+T)占CD4+T細胞百分比變化；B. 肺臟組織中Th1百分比變化統(tǒng)計圖；C. 肺臟組織中Th2百分比變化統(tǒng)計圖；D. 肺臟組織中Th1/Th2比值變化統(tǒng)計圖。*P<0.05，**P<0.005，***P<0.000 1。圖5 不同組別小鼠肺臟組織中Th1、Th2百分比及Th1/Th2比值變化比較

2.6 FACS分析小鼠肺臟組織ILC2百分比變化FACS分析小鼠肺臟組織ILC2(LIN-CD90.2+GATA3+)百分比變化。結(jié)果顯示，HDM組ILC2百分比較CON組顯著增加，hemin干預(yù)后與HDM組比較百分比顯著降低(均P<0.05， 圖6)。

注：A. FACS分析小鼠肺臟組織ILC2(LIN-CD90.2+GATA3+)百分比變化；B. 小鼠肺臟組織ILC2百分比變化統(tǒng)計圖。*P<0.05。圖6 不同組別小鼠肺臟組織中ILC2百分比變化比較

3 討論

過敏性哮喘是一種復(fù)雜的氣道疾病，由于環(huán)境污染及生活方式的改變，其發(fā)病率逐年上升，給社會及個人帶來了嚴重的健康問題及經(jīng)濟負擔(dān)，而其發(fā)病機制目前尚未完全明確。研究表明，Th2型免疫反應(yīng)過度，Th1型免疫反應(yīng)相對減弱是哮喘發(fā)生發(fā)展的重要因素，既往研究認為Th2產(chǎn)生IL-4、IL-5、IL-13等細胞因子促進IgE及大量炎癥介質(zhì)產(chǎn)生，誘發(fā)EOS相關(guān)氣道炎癥[11]。近年研究發(fā)現(xiàn)，哮喘是固有免疫與適應(yīng)性免疫相互作用的結(jié)果，二者共同促進氣道炎癥的發(fā)生，ILC2也可產(chǎn)生Th2型細胞因子，促進過敏性哮喘的發(fā)生發(fā)展[12]。ILC是一群參與固有免疫應(yīng)答的異質(zhì)性淋巴細胞，由于缺少重組激活基因依賴的抗原特異性受體基因的重排，而不表達適應(yīng)性免疫細胞(T細胞或B細胞)抗原特異性受體[13]。ILC主要定位于黏膜屏障，在抵抗病原體入侵、調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)、維持黏膜穩(wěn)態(tài)、促進損傷組織修復(fù)等方面發(fā)揮重要作用[14]。ILC對維持肺臟微環(huán)境的平衡和穩(wěn)定，肺臟固有免疫穩(wěn)態(tài)十分重要，當其數(shù)量或功能異常時，將參與到自身免疫性疾病、過敏、哮喘等的發(fā)生發(fā)展過程中[15]。

Th2和ILC2分別介導(dǎo)適應(yīng)性和固有免疫應(yīng)答。有研究表明，ILC2和CD4+T細胞可通過不同的機制相互激活，具有正向免疫調(diào)節(jié)作用[16]。但是，目前Th2及ILC2在過敏性哮喘發(fā)生發(fā)展中的相對重要性尚不明確[17]。一方面，ILC2可在共刺激分子的作用下向CD4+T細胞提呈抗原，調(diào)節(jié)未致敏T細胞分化，增強過敏原特異性Th2介導(dǎo)的氣道炎癥[18]。已有研究指出，即使沒有適應(yīng)性免疫細胞參與，ILC2也可產(chǎn)生Th2型細胞因子，誘導(dǎo)EOS相關(guān)氣道炎癥[19]。另一方面，研究發(fā)現(xiàn)，BALF中CD4+T細胞活化早于ILC2，提示ILC2的激活可能依賴于T細胞的作用[20]。

HO-1是一種應(yīng)激反應(yīng)蛋白，具有細胞保護和抑炎作用，在細胞受到hemin、重金屬、炎性因子以及CO刺激時均會產(chǎn)生HO-1。hemin作為HO-1的底物能夠通過誘導(dǎo)HO-1高表達保護細胞免受氧化應(yīng)激損傷和炎癥損害。本研究用hemin干預(yù)HDM組小鼠，發(fā)現(xiàn)HO-1高表達能顯著抑制哮喘小鼠氣道炎癥，表現(xiàn)為炎癥細胞浸潤和氣道分泌物均減少、肺臟炎性因子水平降低，表明HO-1能夠緩解過敏性哮喘小鼠氣道炎癥。另外，本研究發(fā)現(xiàn)，誘導(dǎo)HO-1高表達后，小鼠肺臟Th2及Th2型細胞因子水平顯著降低(有P<0.05)，相對應(yīng)的Th1及Th1型細胞因子水平無顯著變化(均P>0.05)，Th1/Th2比值升高，表明HO-1能夠調(diào)節(jié)過敏性哮喘小鼠中Th1/Th2平衡，上述結(jié)果與既往HO-1調(diào)節(jié)以EOS浸潤為主的OVA所致過敏性哮喘氣道炎癥研究結(jié)果一致[8]。此外，研究還發(fā)現(xiàn)，HDM致敏、激發(fā)的小鼠哮喘模型肺臟組織中ILC2數(shù)量顯著增加(P<0.05)。有研究表明，過敏原刺激后，哮喘患者外周血中ILC2是肺組織中浸潤ILC2的主要來源[21]。研究同時發(fā)現(xiàn)，HO-1高表達后ILC2數(shù)量減少，表明HO-1的高表達能夠調(diào)節(jié)ILC2數(shù)量，其是否通過影響ILC2的募集以發(fā)揮作用需要進一步研究。另外，由于Th2與ILC2的相互作用機制尚不明確，本研究不能確定HO-1高表達主要是影響Th2還是ILC2，具體機制有待進一步研究。

綜上所述，HO-1高表達能夠抑制HDM所致過敏性氣道炎癥，其可能通過調(diào)節(jié)Th1/Th2比值及ILC2平衡發(fā)揮作用。本研究為進一步探究HO-1抑制過敏性氣道炎癥的機制提供了一定的實驗基礎(chǔ)。