高山松miR482a的鑒定及其表達分析

王穩利，曾倩倩，劉 巖，邱宗波

（河南師范大學生命科學學院/河南省農業微生物生態與技術國際聯合實驗室，河南 新鄉 453007）

MicroRNA（miRNA）是一類由21～24個核苷酸組成的內源性單鏈非編碼小分子RNA，主要是在轉錄和轉錄后水平指導靶miRNA的剪切或抑制翻譯來調控基因的表達［1］，作為近年來一直研究的熱點調控分子，miRNAs在調控高山松（Pinusdensata）的生長發育［2］、落葉松的體胚發育［3］以及生物和非生物脅迫應答過程中起著重要的作用［4］。

miR482作為植物體內一類重要的miRNA，近年來一直受到研究者們的廣泛關注。利用生物信息學技術，張玉娟等［5］從棉花中鑒定出miR395a、miR396a、miR397a、miR399a、miR414a、miR482b、miR7485等64個與棉花黃萎病抗性相關的miRNA，并對獲得的miRNA進行靶基因預測和功能分析。過表達馬鈴薯miR482e能夠增強植物對黃萎病菌的敏感性［6］。Zuo等［7］研究發現miR482在番茄果實成熟軟化過程中顯示出不同的表達模式。利用高通量測序技術，Li等［8］從豌豆中鑒定出miR482，并發現miR482能夠明顯增加豌豆結莢數目。盡管miR482在多個植物中已有較為深入的研究，但目前在裸子植物高山松中，miR482的鑒定及其在高山松生長發育過程中的功能尚不清楚。

高山松是一種具有重要生態意義的針葉樹裸子植物［9］。本研究從課題組前期高山松小RNA高通量測序結果中獲得miR482a，并利用PCR技術進行miR482a前體序列的克隆與分析。通過在線預測網站獲得miR482a的靶基因，并利用RLM-5′RACE進行驗證。同時還對miR482a及其靶基因在高山松根、莖和針葉中的表達模式進行了分析，為進一步揭示miR482a在高山松生長發育中的作用提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

高山松幼苗于2020年9月在人工氣候室中進行培養，培養條件為晝/夜溫度25℃/18℃，光周期16 h/8 h，相對濕度65%～70%。

1.2 方法

1.2.1 高山松miR482a前體序列的克隆及其二級結構預測 使用植物總RNA提取試劑盒RNAiso Plus Reagent（TaKaRa，大連）從高山松幼苗中提取高質量RNA。從課題組前期高山松miRNA高通量測序結果中得到高山松miR482a的前體序列：UGAGAAGU GAAGGGAUGUGUUUUGUGGAUGGGAGUCUUGAG GAGUGGGAGCAUAGGAUAAGGCUGCUUCAUAUC ACCAGUCUUUCCUACUCCUCCCAUUCCUAUUGCC UUCACCACACAUCCCUUCCCAA。用Primer 5.0軟件設計特異性引物進行PCR擴增（表1）。利用Clustalx 2.0軟件，將高山松pde-miR482a的成熟序列與玉米zma-miR482a、大豆gma-miR482a、火炬松pta-miR482a、毛果楊ptc-miR482a、歐洲云杉pabmiR482、葡萄vvi-miR482以及人參pgi-miR482的成熟序列進行序列比對。并利用MEGA 7.0軟件構建miR482a前體與其他物種miR482前體的系統進化樹。采用RNAfold web server在線軟件預測miR482a前體序列的二級結構。

1.2.2 高山松miR482a靶基因的預測與切割位點驗證 高山松miR482a的成熟序列利用在線預測網站psRNATarget（http：//plantgrn.noble.org/psRNATarget/）進行靶基因的預測。在高山松的轉錄組數據庫中進行miR482a靶基因的預測，設置罰分小于3，其余參數為默認。依據靶基因的cDNA序列用Primer 5.0軟件設計用于RLM-5′RACE的引物（表1）。RLM-5′RACE試驗參照孔雷等［10］的方法，將擴增出的特異產物進行克隆測序。

1.2.3 實時熒光定量PCR 使用RNAiso Plus Reagent（TaKaRa，大連）分別提取高山松幼苗根、莖和針葉的總RNA。利用SuperscriptⅡreverse transcriptase（Invitrogen）進行反轉錄反應。熒光定量試驗使用SYBR Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒（TaKaRa，大連）。高山松Actin作為miR482a和靶基因Unigenes45569的內參基因。利用Rotor-Gene 3000型實時PCR擴增儀檢測，每個樣品3次生物學重復。基因的相對表達量采用2-ΔΔCt法［11］，在根中的表達水平人為設成1。

2 結果與分析

2.1 pde-miR482a前體序列的擴增及二級結構的預測

從前期高山松miRNA高通量測序數據中篩選得到高山松miR482a的前體序列，進行引物設計，以高山松基因組DNA為模板，進行PCR擴增，得到高山松miR482a的前體序列長為130 bp（圖1）。利用RNAfolder軟件在線分析其二級結構，發現高山松miR482a的前體序列能形成典型的莖環發夾結構（圖2），所預測的二級結構的最小折疊自由能（Mini?mal folding free energy，MFE）為-60.90 kcal/mol，最小折疊自由能指數（Minimal folding free energy index，MFEI）是0.98。miR482a的 成 熟 序 列 為5′-UCUU UCCUACUCCUCCCAUUC-3′，22 bp，位于前體序列的3′端莖結構上。

表1 RT-PCR、RT-qPCR和RLM-5′RACE的引物

2.2 高山松miR482a成熟序列和前體序列的分析

對miRBase數據庫中不同植物的miR482a成熟序列與高山松miR482a（pde-miR482a）的成熟序列進行比對，發現除了葡萄vvi-miR482與pdemiR482a的成熟序列完全一致外，其他物種如歐洲云杉pab-miR482、人參pgi-miR482、火炬松ptamiR482a、毛 果楊ptc-miR482a、玉米zma-miR482a以及大豆gma-miR482a與高山松pde-miR482a的成熟序列有一個或多個堿基的差異（圖3），表明高山松pde-miR482a的成熟序列在不同物種中保守性不高。利用MEGA 7.0對毛果楊、玉米、人參、葡萄、火炬松、歐洲云杉、大豆、苜蓿和高山松的miR482共23個成員構建系統發育樹。結果顯示不同物種的pre-miR482前體保守性不高（圖4），高山松與歐洲云杉的前體序列聚為一類，二者進化關系較近。

2.3 高山松miR482a靶基因的預測及RLM-5′RACE驗證

為了進一步了解高山松pde-miR482a的生物學功能，研究以高山松的轉錄組數據庫作為靶標，使用在線軟件psRNATarget預測高山松miR482的靶基因，共預測到2個靶基因，分別為組蛋白去乙酰基酶（Unigenes7264）和NBS-LRR抗 性 蛋 白（Unigenes 45569），其中pde-miR482a與高山松NBS-LRR抗性蛋白（Unigenes45569）匹配程度最高（表2）。

為了進一步驗證高山松miR482a對潛在靶基因是否有剪切作用，利用RLM-5′RACE方法對靶基因Unigenes45569mRNA的3′端剪切產物進行擴增。測序結果表明，高山松pde-miR482a對NBS-LRR抗性蛋白的剪切位點位于第10、第11個堿基之間（圖5），表明NBS-LRR抗性蛋白（Unigenes45569）確實是miR482a的靶基因，miR482a可以在轉錄后水平調控NBS-LRR抗性蛋白基因的表達。

表2 高山松miR482a靶基因及功能預測

2.4 高山松pde-miR482a及其靶基因Unigenes 45569在不同組織中的表達分析

通過qRT-PCR對pde-miR482a及其靶基因Unigenes45569在高山松根、莖和針葉中的表達情況進行分析，發現pde-miR482a和Unigenes45569在高山松不同組織的表達存在顯著差異，pde-miR482a在根中的表達量最高，其次在莖中，而靶基因Unige?nes45569在根中的表達量最低。靶基因Unige?nes45569的表達量與pde-miR482a的表達量呈負相關（圖6）。

3 討論

近年來，高通量測序技術的發展已在多個物種中被證實存在miR482。本研究對鑒定到的miR482前體基因Pre-miR482進行克隆，得到miR482a的前體序列長度為130 bp，可形成穩定的莖環發夾結構，說明miR482a確實在高山松中存在并表達。采用熒光定量PCR技術對高山松pde-miR482a在根、莖和針葉中的表達量進行分析，發現在根、莖和針葉中均有表達，但在根中最高。Li等［8］研究發現miR482在大豆的種子、幼莢、根、莖、葉和花中也均有表達，但在莖中最高。miR482a在番茄的根、莖、葉中均有表達，但在葉中的表達最高［12］。高山松miR482a的靶基因Unigenes45569（NBS-LRR抗性蛋白）在根、莖和針葉中也有一定的表達，但在根中的表達最低，與pde-miR482a的表達模式呈負相關。研究發現大多數miRNA與靶基因之間的表達模式為負相關。過表達和沉默miR482b的番茄植株中，Jiang等［13］發現miR482b和其靶基因表達水平之間存在負相關性。這些研究結果表明，miR482靶向NBS-LRR抗性蛋白（Unigenes45569）可能參與了高山松生長發育的調控。

自從在毛果楊中發現第一個miR482以來［14］，研究者已從棉花［15］、馬鈴薯［6］、番茄［7］和豌豆［8］多個植物中陸續發現了miR482，并且在擬南芥、棉花和煙草等多種植物中證明miR482的靶基因是NBS-LRR基因［15］。而NBS-LRR編碼基因是抗病基因中的最大家族，在植物抵御非生物脅迫及病害防御過程中起著非常重要的作用［16］。棉花受黃萎病菌浸染時，miR482的表達下調，但其靶基因NBS-LRR抗性蛋白表達增加［15］。番茄miR482通過靶向NBS-LRR抗性蛋白在番茄病害的防御和發生中起著重要的調控作用［16］。本研究中，利用RLM-5′RACE方法對預測的靶基因Unigenes45569（NBS-LRR抗性蛋白）進行驗證。結果顯示，高山松miR482介導靶基因Unige?nes45569（NBS-LRR抗性蛋白）的mRNA剪切降解，且剪切位點在第10和第11位堿基之間。利用5′RACE方法，Zhu等［15］在棉花中發現NBS-LRR抗性蛋白是miR482的靶基因，切割位點也在第10和11位堿基之間。這些結果表明，miR482通過靶向NBS-LRR抗性蛋白（Unigenes45569），從而調控高山松的生長發育及抗病性。