螺旋藻多糖提取物對南美白對蝦血淋巴細胞免疫功能的影響

季 露，朱 萌，張 文，于美玲，韋英益，覃志彪，胡庭俊

（廣西大學動物科學技術學院，廣西南寧530005）

在水產養殖中，為保證養殖動物的存活率、實現更高的經濟價值，養殖戶普遍采用增強養殖動物免疫力的手段。免疫增強劑能夠有效提高養殖動物的免疫力，增強養殖動物的淋巴細胞活性，強化其殺菌能力。一般免疫增強劑的藥劑包括多糖類、維生素類、益生菌等[1]。據報道，使用含有褐藻多糖的飼料飼喂斑節對蝦，蝦的生長性能提高，血細胞總數、酚氧化酶活性、呼吸爆發、SOD活性、吞噬活性、細菌清除和殺菌活性增強，表明飼喂添加褐藻多糖的日糧能夠增強蝦免疫系統抵抗副溶血性弧菌感染的能力[2]。在克氏原螯蝦的飼料中添加黃芪多糖能夠不同程度地提高克氏原螯蝦肝胰腺和肌肉中的超氧化物歧化酶、堿性磷酸酶、酸性磷酸酶、過氧化氫酶和溶菌酶活性，表明黃芪多糖能夠提高克氏原螯蝦的免疫功能[3]。螺旋藻多糖是從螺旋藻（Spirulina）中分離提取出來的水溶性天然產物，是螺旋藻的主要生物活性成分之一。螺旋藻多糖可以參與調節細胞活性，具有增強機體免疫力、抗腫瘤、抗病毒、抗輻射和降血糖等作用[4]。本試驗通過CCK8法檢測，篩選獲得螺旋藻多糖提取物對南美白對蝦血淋巴細胞安全濃度，選擇適宜濃度處理對蝦血淋巴細胞12 h，觀察螺旋藻多糖提取物對血淋巴細胞中ACP、AKP和POD活性的影響，以評估螺旋藻多糖提取物對南美白對蝦血淋巴細胞的免疫調節作用。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗藥物

螺旋藻多糖提取物，由廣西大學動物科學技術學院藥理實驗室提取。黃芪多糖，淡黃色粉末，購自北京生泰爾生物科技集團，總糖含量為70%。

1.1.2 試驗細胞

南美白對蝦血淋巴細胞采自廣西水產科學研究院南美白對蝦良種基地提供的SPF級南美白對蝦。

1.1.3 試驗試劑

Leibovitz's L-15培養基（美國，HyClone）；胎牛血清（美國，Gibco）；L-谷氨酰胺、青-鏈霉素、PBS（北京索萊寶科技有限公司）；CCK8（南京諾唯贊生物科技有限公司）；POD（南京建成生物工程研究所，批號：20200102）；ACP（南京建成生物工程研究所，批號：20200103）；AKP（南京建成生物工程研究所，批號：20191226）；BCA（南京建成生物工程研究所，批號：20200102）；檸檬酸三鈉（北京索萊寶科技有限公司）。

1.1.4 試劑的配制

0.01 mol/L PBS溶液：22.40 g的PBS磷酸鹽干粉溶于雙蒸水，定容至2 L，調節pH值7.0～7.2。高壓滅菌（121℃、15 min），封口，保存，備用。

L-15完全培養基（100 mL）：L-15培養液88 mL、胎牛血清10 mL、10×青鏈霉素混合液1 mL、谷氨酰胺1 mL，無菌混合，備用。

5%檸檬酸三鈉抗凝劑：5.00 g檸檬酸三鈉溶于100 mL雙蒸水中，高溫、高壓滅菌，備用。

1.1.5 試驗儀器

C150二氧化碳培養箱（德國，BINDER）、Cellometer Auto 2000細胞計數儀（美國，Nexcelom）、TS100倒置顯微鏡（日本，Nikon）、Tecan Infinite 200 Pro多功能酶標儀（瑞士，TECAN）、Direct-Q 5UV純水系統（德國，Merck Millipore）、JY92-ⅡD細胞超聲破碎儀（寧波新芝生物科技有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 細胞收集

在超凈工作臺中先使用75%酒精噴灑南美白對蝦體表，使用酒精棉球擦拭以除菌。采用加入抗凝劑的2 mL注射器從南美白對蝦頭胸甲后緣與第一腹節的連接處取血淋巴液，在4℃、1 000 g離心10 min，棄去上清，收集細胞，加入L-15完全培養液，使用培養液將血淋巴細胞懸浮起來，保證細胞全部散開。取20μL細胞懸液用于細胞計數，以確定需要加入培養液的量使細胞培養板每個孔中的細胞密度分布均勻。將細胞懸液加入細胞培養板上，培養板置于28℃、5%CO2恒溫培養箱中培養。

1.2.2 CCK8法測定細胞存活率

將上述原代細胞配制成2×106個細胞/mL的細胞懸液。取0.2 mL分別接種到96孔板中，放置于28℃、5%CO2恒溫培養箱中孵育過夜。將細胞分為細胞對照組（不含藥物的血淋巴細胞）、試驗組（含藥物的血淋巴細胞）、空白組（不含細胞及藥物），每組設置6個復孔。細胞貼壁后，棄去上清。在空白組和對照組的孔里各加入0.2 mL培養液，在試驗組孔中分別加入含不同濃度螺旋藻多糖提取物（50、100、200、400、800、1 600 mg/L）培養液0.2 mL/孔。在培養箱中繼續培養24 h，每孔加入CCK8液20μL，培養箱中孵育4 h，在酶標儀上測定各孔的吸光度（OD）值，波長450 nm，每組取6個復孔平均值。用以下公式計算細胞活力。

1.2.3 免疫相關酶活性的測定

設置對照組（不含藥物的血淋巴細胞）、試驗組（含螺旋藻多糖提取物的血淋巴細胞）、陽性藥物對照組（含黃芪多糖的血淋巴細胞），每組設置3個復孔。將原代細胞配制成3×107個細胞/mL的細胞懸液，取2 mL分別接種到24孔板中，放置在28℃、5%CO2培養箱中培養孵育過夜。細胞貼壁后，棄去上清。在對照組各孔中加入2 mL完全培養基，在陽性對照組孔中各加入含200 mg/L黃芪多糖的完全培養基，在試驗組孔中分別加入含不同濃度（50、100、200、400 mg/L）螺旋藻多糖提取物的完全培養基，2 mL/孔。在培養箱中繼續培養12 h，棄去上清，PBS洗細胞2次，每孔再加入1 mL PBS，使用刮刀將細胞刮下來，收集細胞，超聲破碎，測定酸性磷酸酶（ACP）、堿性磷酸酶（AKP）和過氧化物酶（POD）等的活性，嚴格按照試劑盒（南京建成生物工程研究所）操作。

1.3 數據統計與分析

數據利用SPSS 21.0進行單因素方差分析（One-Way ANOVA）分析，使用LSD法進行多重比較，結果以“平均值±標準差”表示。P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 螺旋藻多糖提取物對南美白對蝦血淋巴細胞存活率的影響（見表1）

由表1可知，與細胞對照組相比，當螺旋藻多糖提取物濃度范圍在50～400 mg/L時，對南美白對蝦血淋巴細胞的存活率無顯著影響（P＞0.05）；當藥物濃度為800～1 600 mg/L時，細胞存活率極顯著降低（P＜0.01）。因此，選用螺旋藻多糖提取物50、100、200、400 mg/L作為下一步試驗的濃度。

表1 不同濃度的螺旋藻多糖提取物對南美白對蝦血淋巴細胞存活率的影響Tab.1 Effect of different concentrations of Spirulina polysaccharide extract on activity of blood lymphocytes of Penaeusvannamei

2.2 螺旋藻多糖提取物對南美白對蝦血淋巴細胞中免疫相關酶活性的影響（見表2）

由表2可知，與對照組相比，黃芪多糖組和50、100、200 mg/L試驗組的ACP活性均極顯著升高（P＜0.01）；50 mg/L試驗組的AKP、POD活性均極顯著升高（P＜0.01）；100 mg/L試驗組的AKP、POD活性顯著升高（P＜0.05）；200 mg/L試驗組的POD活性極顯著升高（P＜0.01）；400 mg/L試驗組的AKP、POD活性分別顯著（P＜0.05）、極顯著（P＜0.01）升高。

表2 螺旋藻多糖提取物對南美白對蝦血淋巴細胞中免疫相關酶活性的影響Tab.2 Effect of Spirulina polysaccharide extract on the activity of immune-related enzymes in blood lymphocytes of Penaeusvannamei

3 討論

甲殼類動物由于缺乏脊椎動物的適應性免疫，因此主要依靠先天免疫系統，免疫系統主要由三部分組成：物理防御、細胞免疫和體液免疫[5-6]。甲殼類動物體液免疫主要依靠血淋巴中的酶、免疫因子以及調節因子等[7]。在細胞免疫中，血細胞發揮著巨大作用。血細胞受到損傷時，甲殼類動物的免疫功能將會下降[8-9]。AKP和ACP是反映蝦非特異性免疫功能的重要指標[10]，是甲殼動物溶酶體的重要組成成分，與血細胞的吞噬作用和包囊作用相聯系[11]，可以直接參與磷酸基團的轉移和代謝反應，在甲殼類動物血液和血細胞中起著重要的機體防御作用。劉曉云等[12]研究發現，ACP和AKP以酶原形式存在于小顆粒細胞的顆粒中，過氧化物酶原被合成并儲存在顆粒細胞和小顆粒細胞的顆粒中。在正常健康的蝦機體中，這些顆粒不會在細胞中表現出酶活性。但是，當蝦患病時，顆粒細胞能以細胞解體的方式排出細胞內的顆粒，轉化成有活性的酶，所以導致血清中ACP和AKP活性升高。POD是機體內重要的酶類之一，參與多種生理代謝反應，能夠減少自由基對正常細胞的損傷，清除細胞生理代謝過程中的活性氧，從而提高機體的解毒免疫功能和抗病能力[13]。

多糖能夠提高體外細胞的免疫活性。Li等[14]研究發現，從辣木葉中提取的1種新型多糖（MOP-3），能夠增強巨噬細胞的能力、促進巨噬細胞分泌活性氧（ROS）、一氧化氮（NO）、白細胞介素-6（IL-6）和腫瘤壞死因子-α（TNF-α），表明該多糖能夠激活巨噬細胞產生細胞因子，從而達到對抗病原體的目的。魏文青等[15]在探究海藻硫酸多糖對正常小鼠和免疫低下小鼠免疫功能的研究中發現，海藻硫酸多糖體外對T、B淋巴細胞有促增殖作用；對環磷酰胺所導致的免疫功能低下小鼠，海藻硫酸多糖可以通過調節血象，增加胸腺指數，提高T淋巴細胞數量，促進T、B淋巴細胞增殖來提高小鼠免疫功能。謝鵬[16]研究發現，脂多糖可直接作用于對蝦血細胞，引起總血細胞數量和三類血細胞數量的變化；脂多糖可以增強血細胞的吞噬能力，引起血細胞的胞吐，釋放酚氧化酶原系統。

在本試驗中，與對照組相比，50、100、200 mg/L螺旋藻多糖提取物組的ACP活性均極顯著升高；50、100、400 mg/L螺旋藻多糖提取物組的AKP活性分別極顯著或顯著升高；所有螺旋藻多糖提取物組的POD活性均極顯著或顯著升高，表明螺旋藻多糖提取物可以促進血細胞中酶原顆粒的排出和激活。本試驗結果表明，螺旋藻多糖提取物在一定的濃度范圍內，可以通過促進血細胞中免疫相關酶的釋放和活化來增強機體的非特異性免疫。本研究結果為開發螺旋藻多糖提取物作為南美白對蝦生態健康養殖的免疫增強劑提供參考。

4 結論

螺旋藻多糖提取物濃度范圍在50～400 mg/L時，對南美白對蝦血淋巴細胞的存活率無顯著影響，能夠提高南美白對蝦血淋巴細胞的免疫功能。