核酸適配體在敗血癥實驗診斷中的初步應(yīng)用*

王志瑛，向 韡，李衛(wèi)濱,3△

1.聯(lián)勤保障部隊第九〇〇醫(yī)院檢驗科，福建福州 350025；2.廈門大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，福建廈門 361100; 3.福建醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)技術(shù)與工程學(xué)院，福建福州 350025

敗血癥是由于各種細(xì)菌感染引起的全身炎癥反應(yīng)綜合征，是臨床上常見的重癥感染，也是全球性的公共衛(wèi)生問題。在世界范圍內(nèi)，每年有超過1 800萬人感染敗血癥，其病死率高達(dá)40%[1]。敗血癥病原體的快速檢測，對提高患者的生存率至關(guān)重要。目前，敗血癥實驗診斷的方法主要是檢測C-反應(yīng)蛋白(CRP)、降鈣素原(PCT)、血細(xì)菌培養(yǎng)，存在特異度不理想和檢測時間長等局限性。相比之下，近來出現(xiàn)的基于聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)能夠?qū)⒃\斷時間縮短至數(shù)小時，但是難以在基層醫(yī)院開展。核酸適配體是通過指數(shù)富集的配基系統(tǒng)進(jìn)化(SELEX) 技術(shù)產(chǎn)生的核酸分子探針，相比于傳統(tǒng)的檢測抗體，適配體的生產(chǎn)成本低，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，不存在批間差。檢測靶標(biāo)涵蓋小的有機(jī)分子到復(fù)雜的蛋白質(zhì)或全細(xì)胞，幾乎能與自然界中所有的分子相互作用[2]。肽聚糖為革蘭陽性和革蘭陰性細(xì)菌共有的細(xì)胞壁聚合物[3]，占革蘭陽性菌細(xì)胞壁干重的50%～80%，革蘭陰性菌的細(xì)胞壁干重的5%～20%，Antibac1 和Antibac2 為肽聚糖核酸適配體序列[4-5]，本研究旨在以Antibac1 和Antibac2為分子探針初步建立基于適配體的qPCR新方法用于細(xì)菌檢測。

1 材料與方法

1.1材料 細(xì)菌菌株：大腸埃希菌ATCC 25922，金黃色葡萄球菌ATCC 29213，銅綠假單胞菌ATCC 27853，白色念珠菌，以上均為聯(lián)勤保障部隊第九〇〇醫(yī)院檢驗科微生物室保存菌株。

1.2儀器與試劑 磷酸鹽緩沖液(PBS)由本實驗室配制(137 mmol/L NaCl2,2.7 mmol/L KCl,4.3 mmol/L Na2HPO4·7H2O,1.5 mmol/L KH2PO4)；細(xì)菌培養(yǎng)平板為哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基，購自梅里埃生物制品有限公司；細(xì)菌培養(yǎng)溫箱為35 ℃二氧化碳培養(yǎng)箱，購自美國SHELLAB-2306；比濁瓶為無菌生理鹽水緩沖液，購自梅里埃生物制品有限公司；DENSIMAT細(xì)菌比濁儀，購自梅里埃生物制品有限公司；PCR儀為Bio-Rad的CFX-96 Real-Time System，C1000 Thermal Cycler，操作系統(tǒng)為Bio-Rad CFX Manager，購自美國伯樂公司；熒光染料SYBR Green Ⅰ、PCR Taq Mix、qPCR Mix購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.3適配體與隨機(jī)序列庫 適配體Antibac1：5′-TCG CGC GAG TCG TCT GGG GAC AGG GAG TGC GCT GCT CCC CCC GCA TCG TCC TCC C-3′；適配體Antibac2：5′-TCG CGC GAG TCG TCT GGG GGA CTA GAG GAC TTG TGC GGC CCC GCA TCG TCC TCC C-3′；隨機(jī)核酸序列文庫：5′-TCG CGC GAG TCG TCT GTT CCA ACA TAG TGT CTG ATT TTC TTA ATG GTA GGC GAG CCC GCA TCG TCC TCC C-3′；隨機(jī)核酸序列正向引物：5′-TCG CGC GAG TCG TCT G-3′；隨機(jī)核酸序列反向引物：5′-GGG AGG ACG ATG CGG-3′。隨機(jī)序列的正反向引物與Antibac1和Antibac2的3′端和5′端有相同結(jié)合位點(diǎn)[5]。以上適配體、隨機(jī)序列核酸文庫與引物均由上海生工生物技術(shù)公司合成。

1.4方法

1.4.1菌株培養(yǎng)與調(diào)配 實驗菌株在35 ℃二氧化碳溫箱中培養(yǎng)24 h，挑取3～4個單菌落加入去熱源EP管中，振蕩混勻，室溫用PBS 8 000×g離心10 min洗滌3次，棄上清液，用適量PBS將沉淀吹打混勻，加入測定濁度專用玻璃瓶中，在吸光度600 nm波長下將吸光度值調(diào)整為0.5個麥?zhǔn)媳葷釂挝弧２僮鞣椒▍⒖嘉墨I(xiàn)[6]并根據(jù)實驗室的條件進(jìn)行了優(yōu)化。

1.4.2適配體-細(xì)菌結(jié)合反應(yīng) 將50 μL調(diào)制好的菌懸液加入經(jīng)牛血清清蛋白(去除非特異結(jié)合)包被過夜的EP管中，再加入50 μL的適配體序列Antibac1及Antibac2(0.1 μmol/L)在室溫下震蕩孵育結(jié)合45 min。在上述適配子-細(xì)菌結(jié)合物中加入1 mL PBS，顛倒混勻3次，8 000×g離心6 min洗滌結(jié)合物3次，最后一次洗滌將上清全部棄去。在EP管中加入25 μL無菌水重懸適配體，將EP管置于95 ℃水浴鍋中洗脫適配體5 min，8 000×g，4 ℃條件下離心5 min，吸取1 μL上清(含洗脫適配體)加入20 μL PCR體系進(jìn)行qPCR定量測定。

1.4.3實時qPCR分析 PCR體系：10 μL Mix，3 μL上游引物(10 μmol/L)，3 μL下游引物(10 μmol/L)，3 μL無菌水，1 μL模板(0.1 μmol/L)。 qPCR條件：95 ℃預(yù)變性1 min，40個循環(huán)的95 ℃變性45 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，最后72 ℃延伸5 min，平行實驗3次，以隨機(jī)序列庫作為對照。

1.4.4親和力標(biāo)準(zhǔn)曲線測定 配制PCR反應(yīng)混合體系,先在各管加入17 μL混合體系，再在1～6各管依次加入3 μL梯度濃度的模板，第7管加入3 μL無菌水，各管濃度依次設(shè)為10-6、10-5、10-4、10-3、10-2、10-1、1 μmol/L。

1.5統(tǒng)計學(xué)處理 根據(jù)不同濃度適配體qPCR測定結(jié)果進(jìn)行 Linewaver-Burk的非線性回歸分析，使用公式1/[complex] = kd/[Cmax] × 1/[aptamer] + 1/[Cmax]進(jìn)行計算解離常數(shù)(kd)值。其中kd值是穩(wěn)定狀態(tài)下適配體的解離常數(shù)；[complex]是細(xì)菌-適配體復(fù)合物的濃度；[Cmax]是在適配體的最大結(jié)合效率下，也就是細(xì)菌的所有位點(diǎn)都被適配體占據(jù)的情況下復(fù)合物的濃度；[aptamer]是實驗中適配體的濃度[5]。

2 結(jié) 果

2.1適配體Antibac1的特異度 qPCR-CQ值顯示，0.1 μmol/L適配體Antibac1能夠識別大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌，與白色念珠菌結(jié)合CQ值很低，說明特異度較好,見圖1。

圖1 適配體 Antibac1結(jié)合特異度實驗

2.2適配體Antibac1的靈敏度 將不同濃度適配體Antibac1分別與0.5個麥?zhǔn)蠁挝坏拇竽c埃希菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌菌液結(jié)合，測定CQ值，說明10-6μmol/L適配子可以檢測到1.5×108細(xì)菌數(shù),見圖2。

圖2 適配子Antibac1結(jié)合靈敏度實驗

2.3適配體Antibac1親和力標(biāo)準(zhǔn)曲線 為了進(jìn)一步分析適配子的結(jié)合效率，采用實時qPCR的方法測定了適配體Antibac1和Antibac2對于金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌的結(jié)合力。DNA稀釋度-ΔCQ值的圖表(圖3)顯示適配子Antibac1對不同細(xì)菌的擴(kuò)增效率大致相同，相對于隨機(jī)序列文庫，適配體Antibac1能夠以更高的結(jié)合效率與臨床常見的致病性金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌相結(jié)合。

注：SA表示金黃色葡萄球菌；e.coli表示大腸埃希菌；p表示銅綠假單胞菌。

2.4適配體Antibac1解離常數(shù)kd值的測定 適配體Antibac1對于大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌的kd值分別為33.3、102.7、373.7 μmol/L。而Antibac2對于金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌的結(jié)合不理想，kd值無法計算。適配體Antibac1與大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌的結(jié)合親和力見圖4，kd值越小，親和力越高，說明Antibac1與大腸埃希菌結(jié)合親和力最強(qiáng)。

圖4 Antibac1結(jié)合親和力kd值計算

3 討 論

本研究目標(biāo)聚焦細(xì)菌細(xì)胞壁肽聚糖的適配體Antibac1和Antibac2對細(xì)菌的檢測，采用qPCR方法分析Antibac1和Antibac2與3種敗血癥主要細(xì)菌的特異度與靈敏度及結(jié)合親和力。本研究結(jié)果表明，Antibac1對不同的細(xì)菌結(jié)合效率都較高，不僅能結(jié)合革蘭陽性菌種(金黃色葡萄球菌)，還結(jié)合革蘭陰性細(xì)菌(大腸埃希菌、銅綠假單胞菌)，說明Antibac1能夠識別這3種細(xì)菌細(xì)胞壁中的靶分子，Antibac1的結(jié)合親和力甚至有可能反映出這些細(xì)菌的細(xì)胞壁上肽聚糖的差異[4]。理論上Antibac1與金黃色葡萄球菌結(jié)合親和力應(yīng)該強(qiáng)于大腸埃希菌和銅綠假單胞菌，但結(jié)果其與大腸埃希菌結(jié)合親和力最強(qiáng)，下一步將增加細(xì)菌種類進(jìn)一步驗證[5]。目前，基于核酸適配體的生物傳感器已經(jīng)開始應(yīng)用于細(xì)菌性疾病的檢測[7]。這些細(xì)菌易引發(fā)菌血癥、敗血癥，甚至膿毒血癥，是重要的醫(yī)院獲得感染病原菌，是重癥監(jiān)護(hù)病房感染的常見病原體[8]。

適配體Antibac1和Antibac2檢測結(jié)果的差異，可能是因為兩個適配體的qPCR擴(kuò)增、洗脫條件不同，需要進(jìn)一步優(yōu)化Antibac2與細(xì)菌結(jié)合條件以及PCR擴(kuò)增條件。下一步將合成熒光標(biāo)記的適配體序列，在熒光顯微鏡下確認(rèn)適配體與菌體的結(jié)合，佐證適配體結(jié)合的特異度。另外，qPCR擴(kuò)增時增加 “內(nèi)參序列”，并加入其對應(yīng)的引物序列一起擴(kuò)增以監(jiān)測擴(kuò)增體系的穩(wěn)定性，確保整個擴(kuò)增過程的標(biāo)準(zhǔn)化。

近年來在診斷領(lǐng)域，核酸適配體廣泛應(yīng)用于特異性地識別和結(jié)合多種類型的靶標(biāo)，包括活細(xì)胞或細(xì)菌。適配體作為小分子，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定、生產(chǎn)成本低、生產(chǎn)不存在批間差，另外，其對pH值和溫度等環(huán)境變化具有很強(qiáng)的適應(yīng)性，并且在結(jié)構(gòu)設(shè)計中具有顯著的靈活性。因此，基于適配體的生物傳感器能夠克服傳統(tǒng)的抗體生物傳感器的一些缺點(diǎn)，目前已經(jīng)開發(fā)了多種用于微生物病原體檢測的適配體傳感器[9]。

總之，本研究證實，靶向細(xì)菌肽聚糖的ssDNA適配體能夠識別敗血癥幾種相關(guān)的革蘭陽性與陰性細(xì)菌，Antibac1可用于開發(fā)生物傳感器探針，在臨床中快速檢測細(xì)菌，亦可聯(lián)合使用不同的核酸適配體，提高對于不同類型細(xì)菌的檢測效率，加速診斷和治療，提高敗血癥患者的生存率。