SARS-CoV-2抗體陰性及抗體陽性患者血清炎癥因子表達水平的研究

湯 慶,李 松,鐘元鋒,李 晨,劉 沛,田學文,劉為勇,孫自鏞,李輝軍

華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院檢驗科，湖北武漢 430030

新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)傳播迅速，當前國內外防治形勢異常嚴峻[1-3]。機體感染SARS-CoV-2后可引起適應性體液免疫應答，約7 d會產生針對性IgM抗體，約14 d產生IgG抗體[1]。然而，有報道稱2.0%～8.5%患者在感染SARS-CoV-2后沒有出現SARS-CoV-2抗體[4]。目前國內關于新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)患者不產生抗體的報道較少，本研究對SARS-CoV-2抗體陰性及抗體陽性患者的炎癥因子表達水平進行比較分析，旨在為COVID-19的臨床治療及疫苗研發提供一些參考依據，現報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2020年1—2月華中科技大學同濟醫院中法新城院區定點收治住院確診的COVID-19患者212例為研究對象，按照患者自檢出核酸陽性起2周后是否產生SARS-CoV-2抗體將其分為抗體陰性組44例，其中男性22例、女性22例，平均年齡(52.8±17.9)歲；以及抗體陽性組168例，其中男性80例、女性88例，平均年齡(59.4±13.8)歲；抗體陽性組中含SARS-CoV-2 IgM抗體陽性137例，SARS-CoV-2 IgG抗體陽性168例。納入標準：(1)有流行病學接觸史；(2)有發熱、咳嗽等癥狀，實驗室檢查發現白細胞或淋巴細胞水平降低，胸部CT檢查顯示病毒性肺炎改變，且按國家衛生健康委員會新型冠狀病毒肺炎診療方案(試行第八版)[5]臨床診斷為COVID-19。排除標準：年齡<18歲，急診入院診斷不明確或資料缺失。收集患者的年齡、性別、住院天數、臨床分型、臨床結局、基礎性疾病及呼吸輔助情況等一般臨床資料進行研究分析。本研究通過華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院倫理委員會審核批準。本文屬于回顧性研究免除患者知情同意書。

1.2儀器與試劑 SARS-CoV-2 IgM和IgG抗體采用深圳市亞輝龍生物科技股份有限公司iFlash3000 全自動化學發光免疫分析儀進行檢測，試劑及定標品為原裝配套；全血細胞計數采用日本SYSMEX XN3000全自動生化分析儀進行檢測，試劑為其配套試劑。超敏C反應蛋白(hs-CRP)采用德國羅氏COMBAS 8000全自動生化分析儀進行檢測，試劑及定標品購自日本生研，乳酸脫氫酶(LDH)采用德國羅氏COMBAS 8000全自動生化分析儀進行檢測，試劑及定標品為原裝配套。白細胞介素(IL)-1β、IL-2R、IL-8、IL-10、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)采用SIEMENSIMMULITE 1000免疫分析儀進行檢測，試劑及定標品為原裝配套。IL-6采用Roche e602電化學發光法檢測儀進行檢測，試劑及定標品為原裝配套。檢測標本均按照實驗室標準操作規程進行，保證所有檢測系統平穩無故障且待測項目室內質控均為在控狀態。

1.3方法

1.3.1標本采集及處理 所有患者均于入院24 h內完成靜脈血標本采集，全血細胞計數采用乙二胺四乙酸抗凝劑、hs-CRP采用肝素鋰抗凝劑、D-二聚體及纖維蛋白原(FIB)采用枸櫞酸鈉抗凝劑、細胞因子及SARS-CoV-2 IgM和IgG抗體采用二氧化硅/分離膠的采血管采集。需離心標本采用3 500 r/m離心10 min，不能立即檢測的標本暫存于4 ℃冰箱中，需長期保存的血清/血漿標本放置于-70 ℃保存。

1.3.2SARS-CoV-2 IgM和IgG抗體檢測 患者于入院當日及擇期進行SARS-CoV-2 IgM和IgG抗體檢測，保證所有患者在10～<20 d及20～<30 d均能獲得抗體數據。IgM 和 IgG 濃度<10.0 AU/mL時，為無反應性(陰性)；標本IgM和IgG濃度≥10.0 AU/mL時認為有反應性(陽性)。

1.3.3細胞因子檢測 收到標本時立即對細胞因子進行離心上機檢測，避免放置較長時間。IL-1β、IL-2R、IL-8、IL-10、IL-6、TNF-α參考范圍分別為<5.0 pg/mL、223.0～710.0 U/mL、<62.0 pg/mL、<9.1 pg/mL、<8.1 pg/mL、<7.0 pg/mL。

2 結 果

2.1兩組臨床資料比較 抗體陰性組年齡、住院天數小于抗體陽性組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 COVID-19住院患者一般臨床資料

2.2兩組SARS-CoV-2 IgG、IgM抗體滴度變化 抗體陰性組自檢出COVID-19核酸陽性后10～<20 d及20～<30 d血清中均未檢測出SARS-CoV-2 IgG、IgM抗體。抗體陽性組自檢出COVID-19核酸陽性后10～<20 d及20～<30 d血清中檢出SARS-CoV-2 IgG、IgM抗體。抗體陽性組自檢出COVID-19核酸陽性后20～<30 d SARS-CoV-2 IgG抗體滴度較自檢出COVID-19核酸陽性后10～<20 d升高，而抗體陽性組自檢出COVID-19核酸陽性后20～<30 d SARS-CoV-2 IgM抗體滴度較自檢出COVID-19核酸陽性后10～<20 d降低。見表2。

表2 兩組SARS-CoV-2 IgG、IgM抗體滴度變化[S/CO，M(P25,P75)]

續表2 兩組SARS-CoV-2 IgG、IgM抗體滴度變化[S/CO，M(P25,P75)]

2.3抗體陽性組與抗體陰性組患者入院時實驗室指標之間的差異分析 抗體陽性組WBC、中性粒細胞計數(NEUT)、單核細胞計數(MONO)、RBC、血小板計數(PLT)、IL-2R、IL-10、TNF-α與抗體陰性組比較，差異均無統計學意義(P>0.05)；而抗體陽性組hs-CRP、LDH、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10、D-二聚體及FIB高于抗體陰性組，淋巴細胞計數(LYMPH)、血紅蛋白濃度(HGB)及血細胞比容(Hct)低于抗體陰性組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 SARS-CoV-2 IgM、IgG抗體陽性組與抗體陰性組患者入院時實驗室指標分析

3 討 論

目前由于缺乏COVID-19有效的治療藥物，該病給全球公共衛生系統帶來了巨大挑戰[6]。機體細胞免疫和體液免疫在抗病毒感染中起著至關重要的作用[7]。有研究報道，機體在感染SARS-CoV-2 1周后血清中可檢測到SARS-CoV-2 IgM抗體，發病2周后上升到峰值，3～4周后開始下降，SARS-CoV-2 IgG抗體轉陽的中位數時間為12～14 d[8]。本研究發現抗體陰性組血清中未檢測到SARS-CoV-2 IgG抗體、SARS-CoV-2 IgM抗體，與抗體陽性組相比，抗體陰性組年齡較小，且住院天數較短。抗體陰性組患者年齡較小、恢復較快，可能體內存在其他方式的免疫反應，比如細胞免疫，特異性IgA抗體、細胞因子等促進患者恢復[9]。兩組臨床分型、臨床結局、呼吸機輔助通氣治療方面比較，差異無統計學意義(P>0.05)，可能是由于收治患者病情偏重，同時患者合并基礎疾病較重，如急性腦梗死、急性冠心病、惡性腫瘤等。然而，具體原因還需要后續繼續進行更大樣本及更深入的研究。

SARS-CoV-2感染后，引起機體免疫應答的同時，也活化了各種細胞信號，導致炎癥因子大量釋放，引起細胞因子風暴。炎癥因子的釋放是一種應激反應，一方面有利于病毒清除，然而失控的炎性反應和免疫紊亂會引起多器官免疫病理損傷[10]，有研究表明，COVID-19患者可出現細胞因子水平升高，并與疾病嚴重程度呈正相關[11-12]，可能與患者存在免疫失衡及其導致的細胞因子釋放綜合征(CRS)有關[13]。IL-6 是誘發CRS 的重要因子，可通過上調血管內皮生長因子的表達來破壞血管屏障穩定性，從而刺激單核細胞表達更多的組織因子，加劇外源性凝血系統活化，生成的凝血酶反過來又可誘導血管內皮產生更多的IL-6 及其他細胞因子，這樣“細胞因子風暴”與凝血系統紊亂形成了惡性循環[14]。本研究發現抗體陽性組體內血清hs-CRP、LDH、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10、D-二聚體及FIB水平高于抗體陰性組，表明未檢測到SARS-CoV-2 IgG、IgM抗體的COVID-19患者體內的炎性反應水平較輕。這類患者感染可能局限于呼吸道黏膜細胞，或者感染的病毒載量較小，抗體反應主要由分泌性免疫系統控制，故引起全身性的炎性反應較小。由于抗體陰性組樣本量較少，故本研究中無法在年齡與住院天數進行匹配，關于年齡及住院天數對細胞因子水平是否有影響還需進一步的研究。

綜上所述，本研究發現，未檢測到SARS-CoV-2 IgG、IgM抗體的COVID-19患者相對于抗體陽性患者其體內炎性反應較輕，病程較短，其為臨床治療及疫苗的研發提供一些參考依據。