胃癌患者血清中miRNA-181s表達(dá)與幽門螺桿菌感染的關(guān)系

張 敏，蔡灼遠(yuǎn)，于 莉

儋州市人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，海南儋州 571700

胃癌是我國常見的癌癥之一,其發(fā)生、發(fā)展涉及多種因素，幽門螺桿菌(Hp)感染被世界衛(wèi)生組織(WHO)列為Ⅰ類致癌原，已有大量研究證實(shí)其與胃癌的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切[1-2]。Hp感染損傷胃黏膜屏障，引起的胃部炎性反應(yīng)，影響細(xì)胞內(nèi)信號通路刺激上皮細(xì)胞增殖及修復(fù)，誘導(dǎo)上皮細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化[3-4]。另外，近年來大量研究指出微小RNA(miRNA)的異常表達(dá)與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移等有關(guān)[5-6]。miRNA是一類高度保守的短鏈RNA，通過與靶標(biāo)mRNA 3′端非翻譯區(qū)的結(jié)合來調(diào)節(jié)多種細(xì)胞變化過程。Hp感染可引起miRNA表達(dá)水平的變化，從而影響胃黏膜的炎性反應(yīng)、免疫應(yīng)答及癌基因或抑癌基因的表達(dá)，進(jìn)而參與消化道疾病的發(fā)生和發(fā)展[7]。miRNA-181s家族是備受關(guān)注的miRNA之一，主要包括miRNA-181a、miRNA-181b、miRNA-181c和miRNA-181d。有研究發(fā)現(xiàn)異常表達(dá)的miRNA-181c參與Hp相關(guān)胃癌的發(fā)生、發(fā)展[8]。miRNA-181s家族中其他成員在胃癌中的表達(dá)水平Hp感染的相關(guān)研究甚少。因此，本文旨在通過檢測胃癌患者血清中miRNA-181a、miRNA-181b、miRNA-181c和miRNA-181d的表達(dá)水平，并探討其與Hp感染的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取本院2019年1月至2020年6月收治的胃癌患者50例作為觀察組，其中男性28例、女性22例，平均年齡(56.84±6.05)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)均經(jīng)胃鏡病理證實(shí)為胃腺癌，且均為首次診斷為胃癌；(2)近3個(gè)月未規(guī)律服用過抑酸藥、胃黏膜保護(hù)劑、非甾體類抗炎藥、抗菌藥物。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并其他器官原發(fā)腫瘤；(2)合并免疫系統(tǒng)疾病；(3)重要器官(肝、腎等)功能不全；(4)有惡性腫瘤家族遺傳史；(5)接受過放療、化療、生物治療等。選取同期在本院體檢的健康人群50例作為對照組，其中男性25例、女性25例，平均年齡(57.58±6.16)歲。

1.2儀器與試劑 熒光定量PCR儀(Roche LightCycler 96)為瑞士Roche公司產(chǎn)品。多功能酶標(biāo)儀(Infinite M1000 PRO)為瑞士Tecan公司產(chǎn)品。U6、miRNA-181a、miRNA-181b、miRNA-181c和miRNA-181d引物購自上海生工生物科技有限公司。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Transcriptor First Strand cDNA Synthesis kitmirPremier?microRNA Isolation Kit)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒(SYBR Green PCR Master Mix)、磷酸化信號傳導(dǎo)子及轉(zhuǎn)錄激活子3(p-STAT3)檢測試劑盒、白細(xì)胞介素-6(IL-6)檢測試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司。

1.3方法

1.3.1尿素14C呼氣試驗(yàn)檢測Hp感染 采用尿素14C呼氣試驗(yàn)檢測Hp感染情況,受試者空腹或禁食2 h以上，漱口后口服尿素14C膠囊1粒，靜坐25 min，開啟CO2集氣瓶1瓶，插入潔凈的有防倒流裝置的氣體導(dǎo)管，受試者通過導(dǎo)管吹氣，當(dāng)CO2集氣劑由紫紅色變?yōu)闊o色時(shí)停止吹氣，用潔凈管向樣品瓶內(nèi)加入稀釋閃爍液4.5 mL，加蓋密封，溶解搖勻后于液閃儀上行樣品14C放射性測定3 min。按公式計(jì)算結(jié)果，當(dāng)尿素14C呼氣試驗(yàn)結(jié)果(14C-UBT)≥100 dpm/mmol CO2時(shí)，判定受試者為Hp陽性。

1.3.2血清標(biāo)本采集 所有研究對象于檢查后抽取空腹靜脈血6 mL，于2 h內(nèi)在室溫條件下經(jīng)3 000 r/min離心15 min，留取上層清液(約3 mL)作為標(biāo)本，置于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測血清miRNA-181s 取血清加入細(xì)胞裂解液進(jìn)行裂解后，根據(jù)總RNA提取試劑盒說明書步驟提取總RNA。利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒以RNA為模板逆轉(zhuǎn)錄為模板單鏈cDNA，以cDNA為模板用SYBR Green PCR Master Mix試劑盒進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)程序設(shè)置為 95 ℃ 5 min，預(yù)變性；95 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)；57 ℃ 30 s，延伸。用2-ΔΔCt法計(jì)算血清miRNA-181a、miRNA-181b、miRNA-181c和miRNA-181d相對表達(dá)水平。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.3.4酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)法檢測血清IL-6和p-STAT3表達(dá)水平 根據(jù)IL-6和p-STAT3檢測試劑盒說明書進(jìn)行檢測，具體步驟如下：取出試劑盒板條室溫平衡20 min；標(biāo)準(zhǔn)品孔各加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50 μL，樣本孔加入待測樣本50 μL；隨后每孔加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的檢測抗體100 μL，用封板膜封住反應(yīng)孔，37 ℃恒溫箱溫育60 min；洗板機(jī)洗板5次；每孔加入底物A、B各50 μL，37 ℃避光孵育15 min；每孔加入終止液50 μL，15 min內(nèi)，在450 nm波長處測定各孔的吸光度，計(jì)算各樣本濃度值。

2 結(jié) 果

2.1Hp感染檢測結(jié)果 觀察組Hp陽性患者34例，Hp陰性患者16例，Hp感染率68%；對照組Hp陽性患者16例，Hp感染率為32%，觀察組Hp感染率明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。觀察組Hp感染檢測結(jié)果見表2。

表2 觀察組Hp感染檢測結(jié)果(n)

2.2兩組外周血中miRNA-181s相對表達(dá)水平比較 觀察組miRNA-181a、miRNA-181b、miRNA-181c和miRNA-181d相對表達(dá)水平分別為3.84±0.42、6.29±0.89、5.02±0.51和4.88±0.32，均高于對照組中相應(yīng)的miRNA相對表達(dá)水平(分別為1.11±0.19、1.03±0.16、1.07±0.11和1.02±0.10)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t1=32.49、t2=62.58、t3=47.06、t4=45.97，P<0.05)。

2.3觀察組Hp陽性與陰性患者血清中miRNA-181s相對表達(dá)水平比較 觀察組Hp陽性患者血清中miRNA-181a、miRNA-181b、miRNA-181c和miRNA-181d相對表達(dá)水平分別為4.05±0.33、6.76±0.65、5.26±0.43和5.03±0.28；Hp陰性患者血清中miRNA-181a、miRNA-181b、miRNA-181c和miRNA-181d相對表達(dá)水平分別為3.39±0.17、5.29±0.22、4.52±0.21和4.58±0.12。觀察組Hp陽性患者miRNA-181s相對表達(dá)水平均明顯高于Hp陰性患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t1=7.449、t2=8.828、t3=6.478、t4=6.060，P<0.05)。見圖1。

注：與Hp陰性患者比較，**P<0.05；A為miRNA-181a相對表達(dá)水平,B為miRNA-181b相對表達(dá)水平,C為miRNA-181c相對表達(dá)水平,D為miRNA-181d相對表達(dá)水平。

2.4Hp感染與IL-6/p-STAT3表達(dá)水平的關(guān)系 觀察組Hp陽性患者和Hp陰性患者血清中IL-6表達(dá)水平分別為(717.43±121.57)pg/mL和(531.24±74.68)pg/mL，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=5.629，P<0.05)。觀察組Hp陽性患者和Hp陰性患者血清中p-STAT3表達(dá)水平分別為(14.15±0.90) ng/mL和(12.03±0.87)ng/mL，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=7.804，P<0.05)。

3 討 論

miRNA功能較多，其具有調(diào)控促癌基因表達(dá)、發(fā)揮促進(jìn)惡性腫瘤發(fā)生的作用，以及調(diào)控抑癌基因表達(dá)、發(fā)揮抑制惡性腫瘤發(fā)生的作用[9]。目前，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)約650個(gè)miRNA與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)[10]。miRNA-181s在細(xì)胞增殖、凋亡、分化與耐藥等過程中起到重要的作用[11-15]。ZHANG等[16]推測miRNA-181a可能通過轉(zhuǎn)錄后基因沉默機(jī)制使KLF6蛋白表達(dá)下降,從而促進(jìn)胃癌的發(fā)生、發(fā)展。涂龍霞[17]指出miRNA-181a通過在轉(zhuǎn)錄后抑制TGFβR2蛋白表達(dá)來促進(jìn)胃癌細(xì)胞的遷移和增殖。高楠等[18]研究指出miRNA-181b可靶向調(diào)控NDRG2的表達(dá)從而調(diào)控SGC-7901細(xì)胞的侵襲遷移能力。有研究指出miRNA-181c可能通過甲基化被沉默，并通過其靶基因NOTCH4和KRAS在胃癌發(fā)生中發(fā)揮重要作用[19]。安娟等[20]研究指出胃癌患者血清中miRNA-181d表達(dá)較高且通過作用于PDCD43′-UTR區(qū)發(fā)揮生物功能。姚育紅等[21]研究指出在人胃癌細(xì)胞系中miRNA-181a和miRNA-181b表達(dá)均上調(diào)。本研究結(jié)果顯示，與對照組比較，觀察組血清中miRNA-181s表達(dá)均上調(diào)；與Hp陰性患者相比，觀察組Hp陽性患者血清中miRNA-181s表達(dá)均上調(diào)且以miRNA-181b上調(diào)最為明顯。Hp感染可導(dǎo)致胃黏膜組織中某些miRNA異常表達(dá)，從而引起某些原癌基因、抑癌基因及其相應(yīng)的信號傳導(dǎo)通路障礙，繼而影響胃癌的發(fā)生、發(fā)展[22]。有研究發(fā)現(xiàn)，在Hp感染的胃黏膜組織中，有17個(gè)差異表達(dá)的miRNA與慢性胃炎和促炎癥細(xì)胞因子具有相關(guān)性[23]。miRNA-21是第1個(gè)被發(fā)現(xiàn)受Hp感染影響的miRNA[24]。SAITO等[25]指出Hp感染可能通過miRNA-181b激活I(lǐng)L-6/STAT3信號途徑，進(jìn)而抑制尾型同源盒轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)和p53信號通路，導(dǎo)致胃癌預(yù)后不良。為了進(jìn)一步探討miRNA-181s的作用機(jī)制，本研究同時(shí)檢測了患者血清中IL-6和p-STAT3的表達(dá)水平，結(jié)果顯示miRNA-181s可能通過胃癌的發(fā)生、發(fā)展調(diào)控IL-6/STAT3信號途徑，影響胃癌的進(jìn)展。

綜上所述，胃癌患者血清miRNA-181a、miRNA-181b、miRNA-181c、miRNA-181d水平升高，與Hp感染有關(guān)，且可能通過IL-6/p-STAT3信號途徑影響胃癌的發(fā)生、發(fā)展，從而為胃癌的防治提供一定的理論基礎(chǔ)。