DNMT1單核苷酸多態性與乳腺癌臨床病理特征的相關性*

王 蓉,潘小平,賴金國,杜利軍,楊 園

廣州市花都區人民醫院檢驗科,廣東廣州 510800

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一,嚴重威脅女性的生命健康[1]。研究證實環境因素和遺傳方式可能導致乳腺癌或增加患乳腺癌的風險[2]。DNA甲基化是一種表觀遺傳修飾，在腫瘤基因表達調控、細胞增殖分化等方面起最重要作用。DNA甲基化轉移酶(DNMT)是表觀遺傳學中催化并維持DNA甲基化的重要酶家族。其中DNMT1是DNMT酶家族中最重要也是目前研究最多的一種酶。研究發現DNMT1與DNA異常甲基化有關，從而導致腫瘤的進一步發生、發展,乳腺癌患者外周血中DNMT1 mRNA和蛋白高表達[3]，但是DNMT1多態性與乳腺癌的研究報道較少。本研究選取DNMT1啟動子區域的4個多態性位點rs2114724、rs2228611、rs8101866、rs16999593進行研究，擬通過檢測分析DNMT1多態性位點的基因型與乳腺癌臨床病理特征風險之間的關系，探討DNMT1多態性與乳腺癌發生、發展的相關性。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2018年4月至2019年12月在本院接受乳腺癌手術且經病理學證實為乳腺癌的患者68例作為病例組,年齡31～85歲，平均(46.8±12.2)歲;另選同期體檢健康女性80例作為對照組,年齡28～74歲，平均(44.8±13.9)歲。按照文獻[4]乳腺癌的腫瘤大小判定標準分為T1 21例,T2～T4 47例;按照組織學等級分為G1 15例、 G2 27例、G3 26例;按照是否有淋巴結轉移分為無轉移25例、有轉移43例;按照是否有遠處轉移分為無遠處轉移56例、有遠處轉移12例。所有病例術前均未經任何治療。患者均知情同意，本研究經醫院倫理學委員會批準。

1．2儀器與試劑 郎基A300PCR儀購于浙江杭州飛迪生物有限公司，博日HB-T2-D 金屬浴加熱儀購于杭州諾丁科學器材有限公司，其林貝爾螺旋震蕩儀V6RTAX-5購于北京通世華港設備有限公司，ABI 3730xl測序儀購于美國ABI公司，DNA提取試劑盒TSP201-200、PCR試劑1.1×T3 Super PCR Mix購于廣州擎科生物技術有限公司，SNaPshot反應試劑盒、內標試劑、HiDi緩沖液均由ABI生物技術中國有限公司提供。

1.3DNA提取 病例組和對照組各采集空腹靜脈血3 mL，乙二胺四乙酸二鉀抗凝。按照DNA試劑盒步驟，抽提得到DNA，測定DNA水平及A260/A280值，選用DNA水平為50 ng/μL，A260/A280值為1.70～2.10的樣本，-80 ℃保存、備用。

1.4PCR擴增產物 按照單堿基延伸引物設計原則，DNMT1 4個多態性位點擴增引物見表1。提取的DNA樣品稀釋至20 ng/μL后作為PCR模板。PCR反應體系為25 μL,其中1.1×T3 Super PCR Mix 22 μL，10 μmol/L正向引物1 μL，10 μmol/L 反向引物 1 μL，模板(gDNA)1 μL。PCR反應條件：98 ℃預變性2 min，然后98 ℃10 s、58～61 ℃ 10 s、72 ℃ 10 s，35個循環后，72 ℃延伸5 min。反應產物進行2%的瓊脂糖凝膠電泳。

表1 DNMT1 4個多態性位點擴增引物

1.5PCR產物測序 純化好的混合PCR產物待用，單堿基延伸引物稀釋到10 μmol/L，將各位點的等體積單堿基延伸引物混合，得到混合引物，進行SNaPshot PCR，PCR體系及各組分如下：PCR反應體系為5 μL,其中ABI SnapShot multiplex Mix 2 μL，混合引物 2 μL，純化后PCR模板 1 μL。PCR反應條件為96 ℃預變性2 min，然后96 ℃10 s、50 ℃5 s、60 ℃ 30 s，25個循環。反應產物處理后上ABI 3730xl測序儀進行毛細管電泳測序。

1.6統計學處理 采用統計軟件SPSS18.0分析DNMT1多態性位點基因型頻率分布，并驗證Hardy-Weinberg平衡定律，評估對照組和病例組的基因型，分析各基因型與乳腺癌患者臨床病理特征的關系。為了評估同一基因單核苷酸的相關性，利用Haplo View 4.2 software對DNMT1的4個位點進行了連鎖不平衡和單體型分析。計算相對優勢比(OR)及95%CI，P<0.05表示差異有統計學意義；計數資料比較采用χ2檢驗，病例資料少于5例時采用Fish精確檢驗。

2 結 果

2.1DNMT1單個基因型與乳腺癌風險分析 PCR反應后，得到清晰的擴增條帶。所有樣本經測序后成功分型，經χ2檢驗，在病例組和對照組中DNMT1各位點基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡，見表2。病例組和對照組DNMT1的4個位點的基因型構成比比較，差異均無統計學意義(P>0.05)。見表3。

表2 DNMT1各位點基因型Hardy-Weinberg平衡檢測

表3 DNMT1基因多態性與乳腺癌發病風險性研究

2.2DNMT1基因多態性與乳腺癌臨床病理學指標的分析 病例組DNMT1 多態性位點rs2228611、rs2114724、rs8101866、rs16999593各基因型頻率在乳腺癌臨床病理學指標間比較，差異均無統計學意義(P>0.05)。見表4。

表4 DNMT1基因多態性與乳腺癌臨床病理學指標的相關性研究[n(%)]

續表4 DNMT1基因多態性與乳腺癌臨床病理學指標的相關性研究[n(%)]

2.3連鎖不平衡和單體型分析 DNMT1多態性位點rs2228611、rs2114724和rs8101866之間存在較強的連鎖不平衡并且形成一個單體型模塊，見圖1。為了評估同一基因單核苷酸的相關性，利用Haplo View 4.2 software分析了DNMT1的4個位點連鎖不平衡系數(D′)和相關系數 (r2)，依據D′ 和r2值大小，在同一基因內判斷各單核苷酸之間關聯程度的強弱，對關聯性較強的單核苷酸采用單體型分析，分析所有樣本中常見的單體型及攜帶單體型的相對危險度。發現DNMT1多態性位點rs2114724、rs2228611和rs8101866之間存在較強的連鎖不平衡，r2>0.8，而rs16999593與以上3個位點之間關聯程度較弱，r2<0.2。見表5。對關聯較強的rs2114724、rs2228611和rs8101866位點進行了單倍體型分析，發現研究人群中DNMT1最常見的單倍體型為C、G、T，頻率為68.4%，少見的單倍體型為T、A、T，頻率為3.7%，差異有統計學意義(P<0.05)，表明DNMT1基因中rs2114724、rs2228611和rs8101866位點形成的單倍體T、A、T能顯著增加患乳腺癌的風險。見表6。

表6 所有研究對象DNMT1 單倍體型分析

注：1、2、3、4分別代表rs2114724、rs2228611、rs8101866、rs16999593。

3 討 論

乳腺癌居女性癌癥發病首位[1]。在腫瘤進展過程中啟動子通過調控基因表達發揮了重要的表觀遺傳學作用。DNA甲基化是表觀遺傳學機制最常見的形式，基因啟動子區及附近區域CpG島胞嘧啶的甲基化可以在轉錄水平調節基因的表達，從而引起相應基因沉默[5]。DNA甲基化是指在DNMT的作用下，以S-腺苷甲硫氨酸(SAM)為甲基供體，將甲基基團轉移到胞嘧啶和鳥嘌呤(CpG)二核苷酸的胞嘧啶中5位碳原子上并與其3′端的鳥嘌呤形成 mCpG，且在雙鏈對稱出現。異常的基因啟動子甲基化能抑制多種抑癌基因的表達。目前研究發現的DNMT家族成員至少包括 DNMT1、DNMT2、DNMT3。其中位于染色體19q13.2的DNMT1是以復制病灶為靶點的最豐富的DNA甲基轉移酶，并且在細胞分裂過程中起最主要的、穩定的維持甲基化狀態作用[6]。DNMT1不僅與胚胎發育、細胞衰老有關，也與腫瘤的發生密切相關。DNMT1高表達可以使甲基化模式發生異常，抑癌基因沉默、原癌基因激活導致腫瘤發生[7]。DNMT1的多態性與人類乳腺癌[8]、結直腸癌[9]、卵巢癌[10]等有關。DNMT1在乳腺癌中能導致許多抑癌基因發生甲基化，如P53[11]、PTEN[12]、APG等。目前，有兩項關于中國人群DNMT1多態性與乳腺癌的研究，在黑龍江人口的一項研究中發現中國人群DNMT1 rs16999593的雜合子基因型CT的頻率病例組低于對照組[13]；而在中國南方人群中調查發現相同位點基因型CT能顯著增加患乳腺癌的風險，廣東人群DNMT1 rs2228612位點和重慶人群DNMT1 rs2114724和rs2228611與乳腺癌易感性相關[14]，可以看出結果存在差異。

本研究發現，病例組和對照組在各位點基因型頻率和等位基因型頻率比較，差異均無統計學意義(P>0.05)，位點rs16999593的CT基因型頻率在兩組間并沒有較大差別，與野生基因型TT相比，雜合子基因型CT和突變基因型CC能顯著增加患乳腺癌的風險。SUN等[14]報道在病例組和對照組DNMT1 rs16999593雜合子CT能明顯增加患乳腺癌的風險，這與本研究結論不同。分析可能的原因：(1)研究對象背景不同，遺傳結構可能存在一定差異；(2)納入的符合要求的樣本量不同，可能會導致統計結果偏倚；(3)檢測方法不同，可能會導致檢測結果不一致。擴大符合要求的樣本統計是本課題下一步工作的重要內容之一。此外，在本研究人群中DNMT1(rs2228611、rs2114724、rs8101866)3個多態性位點彼此間存在較強的關聯，4個位點單核苷酸可以形成連鎖不平衡結構圖，這說明中國婦女DNMT1 rs2228611、rs2114724、rs8101866位點多態性可能與乳腺癌易感性相關，還發現樣本中單體型C、G、T的頻率明顯高于單體型T、A、C和T、A、T，差異均有統計學意義(P=0.017)，攜帶T、A、T單倍體型的人群患乳腺癌的風險顯著增加。這與SUN等[14]研究結果不一致，其認為DNMT1基因的位點rs2228611、rs2114724、rs8101866和rs16999593形成的單倍體C、G、T、C能明顯增加患乳腺癌的風險，結論的不同還需要增加樣本量等進一步探討。通過對臨床病理指標的分析發現，在發病年齡、組織學分級、腫瘤大小、淋巴結狀態、遠處轉移、ER和PR狀態等方面，乳腺癌患者DNMT1多態性位點rs2228611、rs2114724、rs8101866、rs16999593各基因型頻率比較差異均無統計學意義(P>0.05)。本研究進一步探討了乳腺癌中DNMT1單核苷酸多態性與以上臨床病理特征的關系，也進一步證明了DNMT1可能參與了乳腺癌的發生，但與病程的發展還有待進一步深入研究。

DNA甲基化是調控基因表達的表觀遺傳學的重要機制之一，DNMT表達狀態影響著細胞基因的表達調控。本研究通過對DNMT1多態性位點的分析評估了其與乳腺癌發生、發展的相關性。位點rs16999593能增加患乳腺癌的風險，但分子機制還有待進一步闡明，今后也將擴大樣本進行分層分析，為乳腺癌的早期篩查、診斷及DNMT1抑制劑的使用提供更加準確的科學依據。