膿毒癥患者外周血CD14+單核細胞HLA-DR、CD86和T淋巴細胞亞群表達水平的變化及其協(xié)同表達研究*

張 盛，唐吉斌△，魯厚清，汪 俊

銅陵市人民醫(yī)院：1.檢驗科；2.重癥醫(yī)學科，安徽銅陵 244000

膿毒癥是機體對感染反應失調(diào)而導致危及生命的器官功能障礙，是創(chuàng)傷、燒傷、休克等臨床急危重患者的嚴重并發(fā)癥之一，也是重癥監(jiān)護室患者主要死亡原因之一[1]。近年來研究表明，在膿毒癥的發(fā)病過程中，機體經(jīng)歷了免疫麻痹階段，即T淋巴細胞無反應，CD14+單核細胞HLA-DR、CD86表達水平下降，導致機體無法控制原發(fā)感染，并增加繼發(fā)感染的易感性[2]。本研究探討膿毒癥患者外周血CD14+單核細胞HLA-DR、CD86和T淋巴細胞亞群表達水平的變化，為臨床提供參考。

1 資料與方法

1.1一般資料 根據(jù)中國膿毒癥/膿毒性休克急診治療指南(2018)的診斷標準[2]篩選膿毒癥患者，選取2020年1-7月銅陵市人民醫(yī)院重癥醫(yī)學科收治且確診的膿毒癥患者44例(膿毒癥組)作為研究對象，其中男性25例、女性19例，平均(69.05±16.02)歲。在標本采集之前，經(jīng)過醫(yī)院倫理委員會驗證。詳細了解入選人群的相關(guān)疾病資料，排除患有免疫功能性疾病(艾滋病、血液系統(tǒng)疾病、腫瘤)和原發(fā)慢性病(高血壓、糖尿病)，以及長期服用激素、免疫抑制劑等人群。另選取同期本院體檢中心20例體檢健康者作為對照組，其中男性10例，平均(65.00±4.90)歲；女性10例，平均(66.20±5.29)歲。兩組年齡比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2方法 采用流式細胞方法，儀器為貝克曼DxFlex流式細胞儀，試劑為BD的CD14PE、CD86PE/Cy7、CD45FITC、HLA-DRAPC及北京同生的CD3FITC-CD8PE-CD45PerCP-CD4APC。收集對照組體檢當日和膿毒癥組入院第1天、第3天及第5天的血液標本，標本為清晨空腹外周血2 mL，注入乙二胺四乙酸二鉀抗凝管。一管用CD14PE-CD86PE/Cy7-CD45FITC-HLA-DRAPC四色方案標記，另一管采用CD3FITC-CD8PE-CD45PerCP-CD4APC四色方案，嚴格按照試劑盒說明書進行操作和結(jié)果判讀。

1.3統(tǒng)計學處理 采用SPSS22.0統(tǒng)計軟件包進行統(tǒng)計分析。膿毒癥組入院第1天、第3天、第5天患者外周血CD14+單核細胞HLA-DR、CD86+CD14+和T淋巴細胞亞群表達水平分別與對照組比較，采用獨立樣本t檢驗。膿毒癥組入院第1天、第3天、第5天患者外周血CD14+單核細胞HLA-DR、CD86+CD14+、總T淋巴細胞、CD4+T淋巴細胞、CD8+T淋巴細胞進行兩兩比較，采用配對t檢驗。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

膿毒癥組入院第1天患者外周血CD14+單核細胞HLA-DR、CD86+CD14+、總T淋巴細胞、CD4+T淋巴細胞表達水平明顯低于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；膿毒癥組入院第3天、第5天患者外周血CD14+單核細胞HLA-DR、CD86+CD14+、CD4+T淋巴細胞表達水平明顯低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 兩組外周血CD14+單核細胞HLA-DR、CD86+CD14+和T淋巴細胞亞群表達水平比較

3 討 論

近年來，隨著研究不斷深入，人們認識到在膿毒癥的發(fā)病過程中，機體并非總是處于一成不變的免疫激活，在膿毒癥的初始階段，以大量分泌炎性介質(zhì)為主要特征，而隨著膿毒癥的進展，機體經(jīng)歷了一個免疫抑制階段，即免疫麻痹。在臨床上，膿毒癥一旦合并免疫抑制，治療也變得相當棘手[3-4]。目前已有很多針對免疫麻痹治療的臨床前研究，例如重組人白細胞介素-17、白細胞介素-15、γ干擾素、粒細胞共刺激因子及粒-巨細胞共刺激因子、PD-1抗體及間充質(zhì)干細胞治療等[5]。對膿毒癥患者進行單純抗炎抑或是改善免疫麻痹治療都是不恰當?shù)模菓摳鶕?jù)膿毒癥免疫狀態(tài)的演變，采取不同的對策。故而正確識別膿毒癥患者的免疫狀態(tài)，實施精準化免疫治療顯得尤為重要[6]。膿毒癥免疫麻痹至今仍未有統(tǒng)一的診斷標準。研究表明免疫麻痹的核心在于T淋巴細胞無反應性，因此，在T細胞被激活至發(fā)揮效應的所有過程，任何環(huán)節(jié)出現(xiàn)問題都會表現(xiàn)出免疫麻痹，目前主要體現(xiàn)在3個方面：(1)單核細胞HLA-DR表達水平明顯減少；(2)抗原提呈能力下降；(3)產(chǎn)生促炎細胞因子的能力明顯下降[7-8]。本研究膿毒癥組入院第1天、第3天及第5天患者外周血CD14+單核細胞HLA-DR、CD86+CD14+均低于對照組，證實了膿毒癥患者體內(nèi)存在免疫抑制。

機體的免疫狀態(tài)是極其復雜的過程，任何環(huán)節(jié)的障礙都會導致免疫麻痹。針對免疫麻痹的監(jiān)測，其中單核細胞HLA-DR表達水平明顯減少(<30%)被認為是多種臨床疾病并發(fā)癥的預測指標[9]。HLA-DR是單核細胞表面表達的具有特征性的受體，它是主要組織相容性抗原復合體Ⅱ(MHCⅡ)的一部分，在外來抗原加工、處理、遞呈及調(diào)節(jié)免疫細胞中起重要作用，其功能是把經(jīng)單核吞噬細胞吞噬并處理后的抗原提呈給輔助細胞繼而激活包括T細胞、B細胞和吞噬細胞在內(nèi)的所有免疫細胞，所以HLA-DR足夠的表達對于特異性免疫和非特異性免疫系統(tǒng)功能都具有重要的臨床意義[10-11]。有研究證實，在外科手術(shù)、燒傷、大面積創(chuàng)傷、腦卒中、胰腺炎等情況下，膿毒癥患者外周血CD14+單核細胞數(shù)量不降低，說明其仍與健康者一樣高表達CD14+，使機體處于防御狀態(tài)，具備對外源性細菌脂多糖等致病因素的潛在識別能力。但患者外周血CD14+單核細胞表面HLA-DR抗原表達受到抑制,可能會使機體的抗感染能力受到一定的影響，其表達水平的減少可預測膿毒癥并發(fā)癥的發(fā)生[11]。有學者研究報道HLA-DR表達水平與膿毒癥患者繼發(fā)感染率和病死率相關(guān)，而且發(fā)現(xiàn)HLA-DR表達水平減少發(fā)生在入院后1.0～4.0 d，繼發(fā)感染多出現(xiàn)在入院后9.4 d，提示HLA-DR表達水平降低能夠在一定程度上提前預知繼發(fā)感染[12]。但是，對于抗原提呈過程，僅具有充足的HLA-DR表達是不夠的，尚需要共刺激分子參與，其中最重要的一對分子是T細胞表面的CD28分子和抗原提呈細胞(APCs)表面的CD80/86相互作用后傳遞給T細胞的共刺激信號[13-14]。當CD80/86表達水平下降，使得單核細胞和T淋巴細胞相互作用的親和力明顯減弱，因此T淋巴細胞不能被激活，導致T淋巴細胞無反應性[15-16]。膿毒癥患者一旦出現(xiàn)免疫麻痹，將會喪失對原發(fā)感染的控制能力，同時增加對患者二次感染的易感性[17-18]。本研究結(jié)果表明，CD14+單核細胞HLA-DR、CD86對于臨床判斷膿毒癥患者的免疫活化功能具有臨床應用價值。與此同時，為了更好地說明細胞的活化功能在膿毒癥患者中的應用價值，本研究還對膿毒癥組入院第1天、第3天及第5天患者外周血T淋巴細胞亞群表達水平與對照組進行比較，通過分析得出膿毒癥組入院第1天、第3天及第5天患者外周血CD4+T淋巴細胞低于對照組，說明膿毒癥患者細胞抗感染功能下降，容易反復感染病原菌。

綜上所述,本研究證實CD14+單核細胞HLA-DR、CD86的協(xié)同表達水平對于評價膿毒癥患者免疫狀況及其預后具有重要的臨床意義。對膿毒癥患者免疫狀況的研究,為合理使用免疫調(diào)理治療提供了理論依據(jù)。