2型糖尿病患者外周血單個核細胞miR-18a、miR-125b相對表達水平與糖脂代謝、炎性因子及胰島素抵抗的關系研究*

侯黎明，劉迎見△，舒閃閃

1.新鄉醫學院附屬商丘市第一人民醫院內分泌科，河南商丘 476100； 2.商丘市婦幼保健院檢驗科，河南商丘 476000

2型糖尿病(T2DM)是內分泌科常見的一種代謝性疾病，主要特點為高血糖，病理基礎為胰島素分泌不足、胰島素抵抗，該病危害性較大，可引起神經性病變，增加病死率[1]。T2DM患者的糖代謝紊亂狀態持續存在，長期胰島素抵抗會影響心肌細胞利用葡萄糖，導致心臟所需能量不足，嚴重時可致心功能損害[2]；脂代謝異常是糖尿病腎病惡化的影響因素之一[3]，在T2DM進展過程中，糖脂代謝異常、炎性因子、胰島素抵抗均會引起T2DM患者病情惡化。近年來，有研究指出，微小核糖核酸(miRNA)參與了β細胞分化、糖尿病腎病等病變的發生、進展過程[4]。有學者發現，miR-125b對胰島細胞凋亡有調節作用[5]。另有研究提示，miR-18a作為miRNA的重要組成部分，參與了多種疾病的慢性應激過程，增加了機體患病風險[6]。單個核細胞包括兩類細胞，分別為淋巴細胞、單核細胞，可吞噬衰老細胞，通過檢測單個核細胞內相關因子表達情況，更能反映機體功能變化[7]。故本研究選取88例T2DM患者作為研究對象，分析T2DM患者外周血單個核細胞miR-18a、miR-125b相對表達水平與糖脂代謝、炎性因子及胰島素抵抗的關系，通過探討相互之間的關系，進一步了解T2DM患者病情，旨在為T2DM治療提供新思路，現報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2019年5月至2020年6月新鄉醫學院附屬商丘市第一人民醫院收治的T2DM患者88例(T2DM組)作為研究對象，另選取同期于該院體檢的健康志愿者65例作為對照組。兩組性別、年齡比較差異無統計學意義(P>0.05)，見表1。研究方案獲該院倫理委員會批準，兩組均對研究內容知情同意。研究對象均符合T2DM診斷標準[8]：出現明顯的糖尿病癥狀，如多食、煩渴多飲、多尿等，且隨機血糖≥11.1 mmol/L；空腹血糖(FPG)≥7.0 mmol/L；口服葡萄糖耐量試驗提示餐后2 h血糖(2 hPG)≥11.1 mmol/L。

表1 兩組一般資料比較

1.2納入、排除標準

1.2.1納入標準 T2DM組：(1)滿足上述關于T2DM的診斷標準；(2)認知狀態、精神狀態正常。對照組：(1)身體健康狀況良好；(2)性別、年齡資料與T2DM組匹配；(3)認知狀態、精神狀態正常。

1.2.2排除標準 (1)出現急性并發癥；(2)腎臟、肝臟、心等臟器嚴重受損；(3)惡性腫瘤；(4)自身免疫性疾病；(5)近6個月內有外科手術史；(6)1型糖尿病或妊娠糖尿病；(7)伴急/慢性感染。

1.3方法

1.3.1樣本采集 兩組于就診或體檢當日，采集5 mL空腹靜脈血，分裝于兩管，一管用于檢測外周血單個核細胞miR-18a、miR-125b，另一管用于檢測糖脂代謝、炎癥指標。

1.3.2外周血單個核細胞miR-18a、miR-125b檢測 采集3 mL空腹肘靜脈血，行抗凝處理，利用密度梯度離心法分離單個核細胞，經Trizol試劑(北京雷根生物技術有限公司，NR0002)對總RNA進行提取，加入Trizol試劑500 μL，充分混合，在室溫下放置5 min，而后加入100 μL氯仿(上海研生生化試劑有限公司，YS-0043B)，震蕩混合，放置2 min，使用高速離心機(湘儀集團，H1650)在4 ℃下行離心處理，時間為15 min，12 000 r/min，將上清液棄除。取100 μL異丙醇(西安晉湘藥用輔料有限公司，497-19-8)加入，充分混合后離心處理，將上清液棄除。取75%冰乙醇100 μL加入，離心后棄除上清液。經空氣干燥機(杭州超濾實業有限公司，CLRD-SA/W)干燥5～10 min，去除蛋白及水分。取焦炭酸二乙酯(美國Amresco，E174-5G)20 μL，使RNA完全溶解，存放于低溫冰箱(中科都菱，MPC-5V1500)待測。經紫外分光光度計(上海光譜儀器，SP-2500)對RNA樣品的純度予以檢測，分別在280、260 nm波長處各測1次，明確A260與A280比值，若比值處于1.8～2.1提示滿足檢測標準。各樣本均取RNA 1 ng經反轉錄成cDNA，反應條件設定為16 ℃ 30 min，42 ℃ 30 min，85 ℃ 5 min。熒光定量聚合酶鏈反應(PCR)反應引物序列如下：miR-18a上游引物為5′-GTG CTA AGG TGC ATC TAG CAG-3′，下游引物為5′-GTG CAG GGT CCG AGG T-3′；miR-125b上游引物為5′-GGA TGG TGT TAT AGG AGG TTG TG-3′，下游引物為5′-CTC TTT CCC CCA AAA CAA ATA TAC-3′；以U6為內參基因，上游引物為5′-CTC GCT TCG GCA GCA CA-3′，下游引物為5′-AAC GCT TCA CGA ATT TGC GT-3′。PCR反應條件為預變性95 ℃ 20 s，變性95 ℃ 10 s、退火57 ℃ 20 s、延伸72 ℃ 15 s，共40個循環，檢測儀器為PCR檢測儀(上海科源電子科技，Quick1600)，經2-ΔΔCt法表示miR-18a、miR-125b相對表達水平。

1.3.3糖脂代謝及炎性因子檢測 將采集的血樣行離心處理，轉速3 000 r/min，離心時間10 min，離心半徑8 cm，分離血清，經博科生物(山東)BK-200全自動生化分析儀與配套試劑測定血清總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)水平。經酶聯免疫吸附試驗法檢測血清白細胞介素(IL)-1β、IL-6、IL-15、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)水平，試劑盒購自江萊生物(上海)，經放射免疫分析法測定空腹胰島素(FINS)，試劑盒購自上海瑞齊生物科技有限公司。經厚美德生物(青島)GLS-77血糖分析儀測定2 hPG、FPG，經涵飛醫療(上海)CS2000糖化血紅蛋白(HbA1c)分析儀測定HbA1c。胰島素抵抗指數(HOMA-IR)=FPG×FINS/22.5。

2 結 果

2.1兩組外周血單個核細胞miR-18a、miR-125b相對表達水平比較 T2DM組外周血單個核細胞miR-18a、miR-125b相對表達水平均高于對照組，差異均有統計學意義(P<0.05)，見表2。

表2 兩組外周血單個核細胞miR-18a、miR-125b相對表達水平比較

2.2兩組血糖及胰島素抵抗指標比較 T2DM組2 hPG、FPG、HbA1c、FINS、HOMA-IR均高于對照組，差異均有統計學意義(P<0.05)，見表3。

表3 兩組血糖及胰島素抵抗指標比較

2.3兩組脂代謝指標比較 T2DM組TC、TG、LDL-C高于對照組，而HDL-C低于對照組，差異均有統計學意義(P<0.05)，見表4。

表4 兩組脂代謝指標比較

2.4兩組血清炎性因子比較 T2DM組血清IL-1β、IL-6、IL-15及TNF-α高于對照組,差異均有統計學意義(P<0.05)，見表5。

表5 兩組血清炎性因子比較

2.5T2DM患者外周血單個核細胞miR-18a、miR-125b相對表達水平與各指標相關性分析 外周血單個核細胞miR-18a、miR-125b相對表達水平與2 hPG、FPG、HbA1c、FINS、HOMA-IR、LDL-C、IL-1β、IL-6、IL-15、TNF-α呈正相關，與HDL-C呈負相關(P<0.05)，但二者與TC、TG無相關性(P>0.05)，見表6。

表6 T2DM患者外周血單個核細胞miR-18a、miR-125b相對表達水平與各指標相關性分析

3 討 論

據國際糖尿病聯盟數據顯示，我國2013年T2DM患病率已高達10.4%[9]。該病發病機制比較復雜，臨床上尚未完全明確其特點，既往研究采用血糖、血脂等常規指標評估患者病情，雖然具有一定價值，但僅能反映糖脂代謝、胰島素反應的變化，存在局限性，臨床仍需尋求可靠指標對其病情進展予以判斷，為治療提供依據。既往有學者認為，過表達的miR-18a可能具有擾亂機體蛋白質代謝，削弱腎臟、血管等生理功能的作用[10]。miR-125b表達可能影響血管平滑肌細胞的分化[11]。臨床通過評估T2DM患者外周血單個核細胞miR-18a、miR-125b相對表達水平，可能有利于進一步了解病情，提出針對性干預方案。

本研究結果顯示，T2DM組外周血單個核細胞miR-18a、miR-125b相對表達水平均高于對照組，差異均有統計學意義(P<0.05)。miR-18a是miR-17-29家族的一員，其異常表達與機體免疫存在關聯，在免疫應答、細胞發育中有重要作用[12]。miR-18a可通過調節酪氨酸激酶-轉錄激活因子通路，促進炎癥介質釋放，導致機體炎癥加重，它在低度炎癥進展中發揮了重要作用[13]。基于此，筆者推測miR-18a可能通過其對炎癥介質的調控作用，參與T2DM進展。有學者認為miR-125b過表達對高糖誘導的炎性反應有促進作用，從而加速內皮細胞損傷，影響內皮細胞功能，這可能是其過表達促進糖尿病進展的原因[14]。研究表明T2DM患者的輔助性、調節性T細胞處于不平衡狀態[15]。而高表達的miR-125b則可能通過影響B淋巴細胞誘導成熟蛋白和干擾素調節因子-4的表達，引起輔助性、調節性T細胞失衡[16]。

本研究結果顯示，與對照組相比，T2DM組2 hPG、FPG、HbA1c、FINS、HOMA-IR及TC、TG、LDL-C顯著升高，而HDL-C下降，差異均有統計學意義(P<0.05)，提示T2DM患者存在糖脂代謝紊亂與胰島素抵抗。糖尿病患者存在糖脂代謝紊亂，這主要是由于患者的胰島素功能障礙或胰島素分泌不足所致，癥狀包括餐后血糖或FPG上調及血脂代謝異常，引起胰島素抵抗及血糖、血脂指標增高[17]。當人機體持續處于高血糖狀態時，會出現膽固醇累積，導致動脈血管壁脂質沉積速度增快，促進動脈粥樣硬化的發生[18]。血脂代謝異常也與胰島素抵抗有關，隨著病程延長，可能出現心肌代謝障礙，引起心肌缺血，胰島素抵抗貫穿于T2DM發病的整個過程[19]。本研究發現,T2DM組血清IL-1β、IL-6、IL-15及TNF-α高于對照組，差異均有統計學意義(P<0.05)，表明患者存在炎癥。持續血糖增高會影響單個核細胞合成功能，促進炎癥介質大量釋放，IL-1β、IL-6、IL-15均為促炎因子，可加重機體炎癥嚴重程度，三者均通過單個核細胞進行釋放，能對趨化蛋白予以介導，對糖尿病患者病情影響較大[20]。TNF-α與糖尿病并發癥發生存在關聯，也可加重糖尿病患者的機體炎癥[21]。基于此，臨床要加強對患者機體炎癥的觀察，以便調整治療方案。本研究最終證實，T2DM患者的外周血單個核細胞miR-18a、miR-125b相對表達水平與2 hPG、FPG、HbA1c、FINS、HOMA-IR、LDL-C、IL-1β、IL-6、IL-15、TNF-α呈正相關，與HDL-C呈負相關，表明患者miR-18a、miR-125b表達與糖脂代謝、炎性因子、胰島素抵抗存在關聯。T2DM患者的糖脂代謝紊亂、炎癥程度、胰島素抵抗相應呈進行性發展，miR-18a可能通過調控炎癥介質促進T2DM進展，miR-125b則可加重高糖誘導的炎性反應程度，引起內皮細胞損害，參與T2DM進展。外周血單個核細胞miR-18a、miR-125b的高表達均可加重T2DM病情，二者相對表達水平越高，意味著血糖控制越差，繼而導致糖脂代謝紊亂、炎性反應與胰島素抵抗進一步加重。

綜上所述，T2DM患者外周血單個核細胞miR-18a、miR-125b表達明顯上調，且這類患者存在糖脂代謝紊亂、炎性反應及胰島素抵抗，而外周血單個核細胞miR-18a、miR-125b表達與上述表現存在相關性。此外，本研究也存在一定的局限性，如樣本量較少，且T2DM發生機制復雜，可能有多個miRNA參與，受研究經費限制本研究僅選擇了miR-18a、miR-125b進行觀察，未來還需加大樣本量對此進行拓展研究。