盧 玲,姚 偉△,龔光遠
1.重慶醫科大學附屬第三醫院呼吸內科,重慶 401120;2.重慶市綦江區人民醫院重癥醫學科,重慶 401420
目前,膿毒癥是造成我國重癥監護病房患者死亡的主要原因之一。據估計,全世界每年發生1 800萬例膿毒血癥[1]。以炎癥風暴為特征,進而導致多器官功能損傷及衰竭,是膿毒癥發生、發展的病理生理學基礎[2]。盡管針對膿毒癥的相關研究,近些年已取得了一定進展,但有效的診斷和治療方法仍相對欠缺。為了降低膿毒癥及相關并發癥的病死率,更好地明確膿毒癥相關的生物學機制至關重要。內質網是負責蛋白質折疊、組裝的細胞器,參與了眾多生理功能。在應激和炎癥狀態下,內質網功能受損,引起未折疊的蛋白應答激活,以重建細胞穩態[3]。但內質網中未折疊蛋白長期積聚,觸發內質網應激,會引發細胞凋亡。越來越多的證據表明,內質網應激與眾多炎癥性疾病及惡性腫瘤的發生及發展相關[4-5]。本研究擬觀察膿毒癥患者外周血單個核細胞(PBMC)中內質網應激相關因子表達水平,并分析其與患者預后的關系。
1.1一般資料 選取2018年1月至2020年8月在重慶醫科大學附屬第三醫院(簡稱本院)就診的膿毒癥患者130例(觀察組)為研究對象。觀察組男75例、女55例,年齡31~72歲、平均年齡(50.5±13.8)歲,體質量指數(25.0±3.1)kg/m2。納入標準:(1)年齡>18~75歲;(2)所有患者均滿足膿毒癥診治指南[6]:對于感染或疑似感染的患者,膿毒癥相關序貫器官衰竭(SOFA)評分較基線上升≥2分。排除標準:(1)數據不完整或不準確的患者;(2)入院24 h內死亡的患者;(3)患慢性疾病的患者如惡性腫瘤、自身免疫性疾病等;(4)近期接受免疫抑制劑治療的患者;(5)未簽署知情同意書的患者。根據觀察組患者預后分為存活組(96例)和死亡組(34例)。另選取50例健康志愿者為對照組,均來自同期同一醫療機構的健康體檢中心,其中男28例,女22例,年齡32~70歲,平均年齡(51.3±14.0)歲,體質量指數(25.2±3.5)kg/m2,觀察組與對照組在性別、年齡、體質量指數等方面比較,差異無統計學意義(P<0.05)。該研究獲得本院倫理委員會批準,并征得患者家屬知情同意。
1.2方法
1.2.1檢測內質網應激相關因子mRNA表達水平 收集所有研究對象外周血3 mL,提取單個核細胞(PBMC),采用實時定量PCR檢測內質網應激相關因子mRNA表達水平。具體檢測方法見相關參考文獻[7],簡要步驟包括設計引物(引物序列見表1)、RNA提取、逆轉錄、擴增等。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)為內參,使用2-ΔΔCt方法計算相對mRNA表達水平。

表1 引物序列
1.2.2檢測內質網應激相關基因蛋白表達水平 提取各組PBMC,在RIPA裂解緩沖液中進行冰育裂解20 min,經離心后收集上清液,BCA法測定蛋白濃度。配置10%電泳液,進行蛋白免疫印跡,檢測內質網應激相關蛋白表達水平。具體操作可見參考文獻[8],簡要步驟如下:每孔加入等量蛋白,經電泳、轉膜、封閉、一抗孵育(抗CHOP抗體和抗ATF-6抗體均為1∶500,抗GAPDH抗體為1∶800)、洗滌、二抗孵育、洗滌及顯影等。以GAPDH為內參,計算內質網應激相關蛋白條帶與GAPDH灰度比值。
1.2.3檢測PBMC中部分炎性和氧化應激指標 收集所有研究對象空腹靜脈血3 mL,經抗凝離心后,獲取血清,采用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)法測定不同組間PBMC中部分炎性指標[白細胞介素(IL)-1β、IL-6]和氧化應激指標[超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)]水平。具體檢測方法見相關試劑盒說明書,炎性指標試劑盒購自南京建成生物公司,氧化應激指標試劑盒購自武漢博士德生物公司。

2.1對照組與觀察組PBMC中內質網應激相關因子mRNA及蛋白表達水平比較 與對照組比較,觀察組患者PBMC中內質網應激相關因子CHOP和ATF-6 mRNA及蛋白表達水平顯著升高(P<0.05),見表1及圖1。

表1 兩組外周血內質網應激相關因子mRNA表達水平比較
2.2對照組與觀察組PBMC中部分炎性及氧化應激指標水平比較 與對照組比較,觀察組PBMC中部分炎性指標IL-1β、IL-6水平和氧化應激指標MDA水平顯著升高,而抗氧化應激指標SOD水平顯著降低,差異均有統計學意義(P<0.05),見表2。

表2 兩組PBMC中部分炎性和氧化應激指標水平比較
2.3不同預后組間PBMC中內質網應激相關因子mRNA和蛋白表達水平比較 與存活組比較,死亡組患者PBMC中內質網應激相關因子CHOP和ATF-6 mRNA及蛋白表達水平顯著升高,差異有統計學意義(P<0.05),見表3。

表3 不同預后組PBMC中內質網應激相關因子mRNA和蛋白表達水平比較
2.4不同預后組PBMC中部分炎性及氧化應激指標水平比較 與存活組比較,死亡組PBMC中部分炎性指標IL-1β、IL-6水平和氧化應激指標MDA水平顯著升高,而抗氧化應激指標SOD水平顯著降低,差異均有統計學意義(P<0.05),見表4。

注:與對照組比較,aP<0.05。

表4 不同預后組PBMC中部分炎性和氧化應激指標水平比較
2.5相關性分析 觀察組PBMC中CHOP和ATF-6 mRNA分別與IL-1β(r=0.450,P=0.019;r=0.493,P=0.017)、IL-6(r=0.413,P=0.025;r=0.445,P=0.019)、MDA(r=0.540,P=0.013;r=0.590,P=0.008)水平呈正相關。而與SOD水平呈負相關(r=-0.514,P=0.016;r=-0.499,P=0.017)。
2.6ROC曲線分析 觀察組PBMC中CHOP和ATF-6 mRNA的ROC曲線下面積(AUC)分別為0.852(95%CI:0.775~0.929)和0.840(95%CI:0.755~0.926),靈敏度分別為77.27%和76.92%,特異度分別為84.91%和79.49%,見圖2。

圖2 ROC曲線分析
膿毒癥引發眾多器官功能不全,造成高致死率,是目前臨床面臨的重大醫學問題。膿毒癥發病機制極其復雜,包括炎性反應、免疫功能障礙、線粒體損傷、神經內分泌免疫網絡異常、自噬及其他病理生理過程,最終導致器官功能障礙[9]。最近研究表明,內質網應激信號與膿毒癥引起的組織細胞死亡有關,在膿毒癥細胞及動物模型中,未折疊或錯誤折疊的蛋白質積聚在內質網中,改變其穩態,導致氧化應激和鈣超載,促進內質網應激通路的激活[10]。抑制內質網應激信號,可顯著降低膿毒癥引起的細胞凋亡,降低炎性反應,改善器官功能[11]。在膿毒癥患者人群中,內質網應激相關因子表達水平如何,并且與預后的關系,目前尚未闡明。
研究顯示,內質網應激信號通路的激活與多種疾病如糖尿病、高血壓、缺血再灌注損傷等發生、發展密切相關[12-14]。抑制內質網應激,可穩定蛋白質構象,促進未折疊或錯誤折疊的蛋白質轉移出內質網,提示抑制內質網應激信號可能是疾病治療的重要靶點[15]。內質網應激主要包含3條信號通路如CHOP的轉錄激活,肌醇酶-1及ATF-6激活。膿毒癥大鼠中,心臟組織內質網應激主要成分CHOP顯著上調,可作用于腫瘤壞死因子受體家族或內質網氧化還原1樣蛋白,引起過量的鈣離子從內質網運輸至線粒體,觸發鈣依賴型細胞凋亡通路[16]。ATF-6作為內質網未折疊蛋白反應中關鍵的應激蛋白,當受到壓力時被切割為具有轉錄因子活性的蛋白,并從高爾基體膜轉位至細胞核中,激活靶基因的表達,從而參與調控內質網應激反應,維持細胞內蛋白質穩態[17]。在內質網應激狀態下,ATF-6過度激活可導致與內質網相互作用的多個膜性細胞器穩態的失衡,包括核膜的皺縮、異染色質的丟失及線粒體結構和膜電勢的紊亂,促進半胱氨酸蛋白酶-3凋亡通路激活[18-20]。本研究結果顯示,與對照組比較,膿毒癥患者PBMC中內質網應激顯著激活,同時下游炎性和氧化應激指標顯著上調,表明內質網應激促進了下游炎癥及氧化應激反應,參與了膿毒癥的發生過程。相關研究顯示,內質網應激可促進炎癥及氧化應激激活,降低大鼠血管舒張反應,升高血壓,而給予內質網應激抑制劑處理,可顯著逆轉上述異常反應[21]。觀察組根據膿毒癥預后進行分組,研究結果提示,死亡組患者內質網應激及下游通路顯著較存活組增強。ROC曲線分析顯示,PBMC中內質網應激相關因子(CHOP和ATF-6 mRNA)對膿毒癥患者預后的評估價值較高,提示這兩項指標具有一定的臨床運用價值。內質網應激的激活參與了膿毒癥的發生、發展過程,其相關標志物不僅可作為評估膿毒癥患者預后的有效指標,還可能為其治療提供有效的靶點。
膿毒癥患者PBMC中內質網應激顯著激活,其相關因子可作為評估膿毒癥患者預后的有效指標,但膿毒癥患者中,內質網應激的上游調控機制尚不清楚,還需動物及細胞實驗進一步探索及驗證。