不同季節新鮮鴨蛋表面污染細菌的多樣性分析

盧昌麗，熊香元，龔慧可，任佑華，陳力力*，劉 焱*

（湖南農業大學食品科學技術學院，食品科學與生物技術湖南省重點實驗室，湖南 長沙 410128）

據報道2019年我國禽蛋產量高達3 308.98萬 t，其中鴨蛋約占禽蛋總量的20%，鴨蛋生產已成為我國禽蛋的重要組成部分[1]。鴨蛋富含蛋白質、磷脂、磷脂、VA、VB2、VB1、VD、礦物質及人體必需氨基酸等營養物質[2-3]。《醫林纂要》記載，鴨蛋補心清肺，止熱嗽，治喉痛。百沸湯沖食，清肺火，解陽明結熱[4]。長期以來鴨蛋備受消費者的喜愛，近十年數據統計表明，人們對禽蛋的需求量逐年遞增[5]。同時，鮮鴨蛋的質量與衛生直接關系到消費者的食用安全，因此也備受關注[6]。

鴨的生活習性喜水、好合群，人們常利用江河、湖泊、水塘等天然養殖場，采用放養、散養的飼養方式[7]。鴨的腹大腿短，臀部豐滿且略下垂，羽毛容易受環境污染[8]；另外鴨下蛋無固定場所，使蛋殼表面很容易黏有污泥、墊草、糞便，導致細菌生長繁殖；隨著貯藏時間延長，蛋殼表面的細菌能經過蛋殼上的氣孔水平傳播進入蛋內，在條件適宜時會大量生長繁殖[9]。前期研究表明鴨蛋殼表面帶菌數在106以上，其表面菌落總數與同一環境中飼料、墊草及空氣的菌落總數呈正相關[10]。

由于一年四季的氣溫、濕度、降雨量、光照等氣候條件有所不同，因此，不同季節生產的鴨蛋衛生品質也有所差別[11]。高通量測序技術作為近十年發展最迅猛的生物技術，因其相對于傳統培養和國標法具有高覆蓋度、高靈敏度、高準確性和低成本等特點，在食品微生物生態學研究中被廣泛應用，目前已在分析食品微生物多樣性、評價食品發酵和貯藏過程中微生物群落結構變化、監測食源性病原菌動態特征以及控制食品質量等方面發揮出無可比擬的優勢[12]。張雅靖等[13]采用Illumina高通量測序方法，對撒壩火腿表面和內部細菌的16S rDNA V3-V4區和真菌ITS2區進行擴增和測序，分析群落構成和多樣性，結果表明樣品細菌的豐度及多樣性高于真菌，且內部真菌和細菌微生物多樣性和豐度均高于表面，并且發現曲霉和葡萄球菌是撒壩火腿表面和內部的優勢菌群。Mu Yu等[14]利用Illumina MiSeq平臺進行盤縣火腿加工過程中的微生物群落分析時，同樣得出細菌群落比真菌群落更為復雜的結論。毛俊龍等[15]為了探究茶黃素對低溫貯藏大黃魚表面附著微生物組成的影響，對不同處理大黃魚表面附著微生物進行基因組DNA提取及高通量測序、多樣性指數分析比較，證明0.3 mol/L茶黃素對冷藏和凍藏大黃魚分別進行浸泡處理，相較于空白處理和0.3 mol/L VC溶液浸泡處理而言，具有較好的抗氧化性，對脂肪含量較高的大黃魚表面微生物菌落組成有一定的影響，可以抑制部分菌屬生長，延長大黃魚貯藏時間。本實驗擬通過Illumina MiSeq高通量測序技術分析春夏秋冬不同季節鴨蛋殼表面細菌的多樣性，從多樣性指數、不同分類水平物種種群及豐度的差異性和相似性比較季節因素對鴨蛋表面細菌污染的影響，為鴨蛋的潔蛋、保鮮以及加工過程中相關措施的制定提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

從洞庭湖區定點養殖場分別在春、夏、秋、冬季節（3月、6月、9月、12月），參照國家“獸藥殘留抽樣檢測技術操作要點”的抽樣辦法[16]，定期采集新鮮鴨蛋80 枚，分別裝入無菌采樣袋，帶回實驗室并在12～20 h內處理。

細菌基因組DNA提取試劑盒、凝膠回收試劑盒、聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增試劑盒 北京全式金生物技術有限公司；無菌采樣袋（229 mm×140 mm） 北京士博瑞科技有限公司。

1.2 儀器與設備

1704467 瓊脂糖凝膠電泳儀 美國Bio-Rad公司；ABI GeneAmp9700型PCR儀 愛普拜斯公司；SP-752紫外-可見分光光度計 上海元析儀器有限公司；Quanti Fluor TM-ST藍色熒光定量系統 普洛麥格（北京）生物技術有限公司；MiSeq高通量測序平臺 美國Illumina公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理

隨機從每批樣品鴨蛋中抽取20 枚，各加入100 mL無菌生理鹽水，常溫條件下置于超聲波清洗器中處理50 s，收集洗蛋水混合液作為春夏秋冬四季的樣品（Y1、Y2、Y3、Y4），隨后將4 個混合液樣品各分為4 份，編號LY1、DY1、HY1、YY1春季樣品；LY2、DY2、HY2、YY2春季樣品；LY3、DY3、HY3、YY3春季樣品；LY4、DY4、HY4、YY4春季樣品。備用。

1.3.2 細菌總基因組DNA提取

上述16 個樣液各取5 mL收集菌體，按照細菌基因組DNA提取試劑盒說明書抽提出總的基因組DNA。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測總DNA的完整性后，利用紫外分光光度計測定OD260，得到DNA濃度，并考察OD260/OD280。

1.3.3 PCR序列擴增和Illumina MiSeq測序

過濾總序列中不合格的DNA模板，對合格的文庫根據Illumina MiSeq測序區域（V4+V5），采用合成帶有barcode的特異引物進行細菌16S rDNA PCR擴增，引物分別為Primer 338F（5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3）和Primer 806R（5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3）。將PCR產物經膠回收純化，高通量測序工作上海美吉生物工程有限公司完成。

1.4 數據整理與統計分析

根據barcode序列區分各個樣本reads。然后去除嵌合序列，得到可用于后續分析的有效數據，即Clean reads。用相應的軟件進行細菌操作分類單元（operational taxonomic units，OTU）（在97%的相似水平下）聚類分析和繪制稀釋曲線；α多樣性指數分析，包括有計算菌群豐度指數Chao和ACE，菌群多樣性指數Shannon和Simpson，測序深度指數覆蓋率。基于以上數據分析的合理性，用Venn圖統計多個樣本中共有和獨有的OTU數目，再一步進行UniFrac的主坐標分析（principal coordinate analysis，PCoA），差異性和相似性；分析門、科、屬和種各水平上物種組成的豐度和多樣性，將聚類后屬水平上的數據表示在熱圖上，可將高豐度和低豐度的物種分塊聚集，通過顏色梯度及相似程度反映多個樣本在各分類水平上群落組成的相似性和差異性。

2 結果與分析

2.1 Illumina MiSeq測序數據統計與質量分析

樣品總基因組DNA的1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測結果表明，電泳目的條帶清晰，OD260/OD280比值表明其濃度和純度均符合用于PCR擴增。通過對16 個樣品的PCR擴增產物進行Illumina MiSeq測序，共獲得697 244 條優化序列，按97%的相似度聚類后歸為650 個OTU，包括35 個門，298 個屬。隨機抽取樣品基因組中一定數量的序列個數與它們所代表的物種數目構建稀釋曲線，如圖1所示，稀釋曲線逐漸趨于平坦，說明測序數量足夠充分合理，可以進行下一步的數據分析。

圖1 相似度為97%條件下各樣品的稀釋曲線Fig.1 Rarefaction curves of each sample at similarity of 97%

2.2 細菌群落的多樣性分析

2.2.1α多樣性分析

如表1所示，樣本中序列被測出的概率高達99%，說明該數據能有效代表樣本中微生物的真實情況。冬季樣品Y4組（LY4、DY4、HY4、YY4）的ACE指數和Chao指數值最大，平均分別為587.5±17.82和596.5±22.29，菌群豐度明顯高于其他3 組季節樣品；Shannon指數最大和Simpson指數最小，平均分別為3.52±1.02和0.1±0.07，種群復雜度表現最為突出。不同季節的菌群多樣性排序為Y4（冬季樣品）＞Y1（春季樣品）＞Y2（夏季樣品）＞Y3（秋季樣品），其中HY4菌群多樣性最高。

表1 α多樣性指數Table 1 α-Diversity index

2.2.2 Venn圖分析

Venn圖可用于統計多個樣本在相似水平為97%下所共有和獨有的物種OTU數目，可以比較直觀地表現樣本的物種數目組成相似性及重疊情況。由圖2可知，4 組樣品有35 個共有OTU，分別占各樣品OTU數目的0.06%～70%，重疊度較小，說明各個季節鴨蛋殼表面的菌群種類具有較大的差異性。獨有的OTU數目分別為Y1 9 個、Y2 0 個、Y3 17 個、Y4 496 個，在Y1獨有的OTU中占比最大的為變形桿菌門（Proteobacteria）的淤泥假單胞菌（Pseudomonas_caeni），有研究表明淤泥假單胞菌是抗生素耐藥基因的主要宿主菌[17]，會加速耐藥致病菌的產生；Y3中豐度較大是水中最為常見細菌之一弧菌屬（Vibrio），可引起腸道感染的細菌，它會引發腸胃炎和霍亂等疾病[18]；Y4主要有Candidate_division_SR1門，變形菌門的β-變形菌綱脫氯菌屬（Dechloromonas）屬于反硝化細菌可以抑制植物性致病菌，梭狀芽孢桿菌的小紡錘狀菌屬（Fusibacter）和擬桿菌門的Bacteroidetes_vadinHA17科等其他微生物共同作用下降解為反硝化過程提供碳源的物質[19]。湖南冬季氣溫較低，陰濕多雨，氣候環境并不適宜細菌繁殖，但冬季鴨群喜聚團保暖，不常活動，使鴨子抵抗力降低，另由于環境衛生等因素造成鴨蛋表面微生物菌群復雜。而夏季高溫少雨，暑熱時期長，紫外照射時間長，鴨子天熱時經常下水，鴨體較為干凈，活動較為分散，減少相互之間的細菌滋生。

圖2 不同季節樣品共有和獨有OTU Venn圖Fig.2 Venn diagram of unique and shared OTUs of the bacterial communities in different seasons

2.2.3 基于UniFrac的PCoA

首先結合樣本OTU的種類及其相對豐度，通過一系列的特征值和特征向量進行排序后，選擇主要排在前幾位的特征值，PCoA可以找到距離矩陣中最主要的坐標，結果為數據矩陣的一個旋轉，它沒有改變樣本點之間的相互位置關系，只是改變了坐標系統。UnifracPCoA基于進化距離，在進化水平上挖掘影響樣品群落組成差異的潛在主成分，繪制PCoA聚類圖。PC1的貢獻率為70.14%，PC2的貢獻率為15.12%，當PC1和PC2的總解釋度達40%就可用于后續的樣品差異性分析。由圖3可知，16 個樣品中，每個季節的樣品組聚類效果均較優，其中春季（Y1）組和夏季（Y2）組的樣品相互聚類到一起，而其他組別均出現明顯差異。整體來看，組內菌群差異不顯著，但組間菌群豐度差異顯著。

圖3 基于UniFrac的PCoA聚類分析Fig.3 PCoA clustering analysis based on UniFrac

2.3 樣品物種組成分析

2.3.1 門和科水平物種組成分析

本研究共注釋得到35 個門，其中絕大多數是厚壁菌門（Firmicutes）和變形菌門（Proteobacteria），分別占比59%和38%，其余的33 個門水平物種不到3%。在科分類水平上，共得到200 個科，圖4為各樣品相對豐度大于1%的科水平物種的多樣本柱狀圖（相對豐度低于1%的部分合并為other）。在4 組樣品中占比較大的有5 個科，分別為腸桿菌科（Enterobacteriaceae）占比28.22%（18.53%～33.34%），桿菌科（Bacillaceae）占比17.77%（10.20%～25.42%），腸球菌科（Enterococcaceae）占比17.18%（12.41%～23.63%），梭菌科_1（Clostridiaceae_1）占比9.21%（4.20%～15.45%），扁球菌科（Planococcaceae）占比6.41%（3.19%～8.85%）。

圖4 不同季節多樣品科水平菌種群組成圖Fig.4 Phylum-level composition of microflora in different seasons

2.3.2 屬水平物種相對豐度及熱圖分析

物種組成分析顯示，大部分OTUs都可以注釋到屬水平。為了解菌群的分布情況，采用RDP classifier貝葉斯算法對97%相似水平的OTU代表序列進行分類學分析，統計在屬分類水平上每個樣品的菌群組成，共得到298 個屬，其中Y1擁有49 個屬，Y2擁有32 個屬，Y3有85 個屬，Y4有285 個屬。由表2可知，各樣品的優勢菌屬，其中Y1埃希氏菌屬-志賀菌屬（Escherichia-Shigella）相對豐度最大（25.61±10.42）%；Y2腸球菌屬（Enterococcus）相對豐度最大（19.74±9.31）%；Y3和Y4的芽孢桿菌屬（Bacillus）相對豐度最大，分別為（25.42±18.16）%和（18.27±14.09）%。這說明氣溫對芽孢桿菌屬無明顯影響，在蛋殼表面普遍存在，但氣溫對志賀菌影響顯著，過高（Y2）或過低（Y4）都能抑制其生長。Y4的others（即相對豐度低于1%）物種占比為（22.53±20.01）%，說明其物種多樣性明顯高于其他3 組樣品。此外在屬水平上發現有腸桿菌（Enterobacter）、溶菌桿菌（Lysinibacillus）、梭菌（Clostridium_sensu_stricto_1）、厭氧桿菌（Aneurinibacillus）等普通方法難以分離鑒定的細菌序列。

表2 不同季節屬水平樣品相對豐度分布統計Table 2 Statistics of relative abundance distribution at genus level in different seasons

熱圖可以用顏色變化反映樣品物種豐度的數據信息，直觀地將數據值的大小以定義的顏色深淺表示，如圖5所示，顏色由藍色到紅色分別代表相對豐度為0%～50.53%。通過顏色的梯度及相似程度，能更清晰地反映各樣品屬水平上群落結構的相似性和差異性。圖5中冬季（DY4、HY4、LY4、YY4）樣品中的顏色明顯比其他3 組偏綠，說明其菌群的相對豐度高于其他3 個季節的菌群豐度，且物種多樣性也明顯比其他3 組高。從橫向看樣品中有不同深淺顏色的深綠色、亮黃色到紅色，表示這些菌群在樣品之間有較高的相似度，雖然存在顏色差異，豐度有些許不同，但也說明它們是樣品中普遍存在的群落，都含有梭狀芽孢桿菌1型屬（Clostridium_sensu_stricto_1）、腸桿菌屬（Enterobacter）、埃希氏菌屬-志賀菌屬（Escherichia-Shigella）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、腸球菌屬（Enterococcus）、消化鏈球菌屬（Peptoclostridium）、賴氨酸芽孢桿菌屬（Lysinibacillus）、葡萄球菌屬（Staphylococcus）[20]。在其他某些藍色的區域出現，則說明只是一部分的菌屬或樣品具有相似度，例如，酸性氨基桿菌屬（Acidaminobacter）、未分類禽桿菌（Rhodocyclaceae_unclassified）和擬桿菌（Marinilabiaceae）僅Y4中有存在草綠色區域，其他均為藍色；禽桿菌科（Rhodocyclaceae）的陶厄氏菌屬（Thauera）和Parcubacteria_norank在Y3和Y4為黃綠色區域，其他均為藍色，說明兩兩菌屬之間具有較高的豐度相似度，但樣品間的差異極大。

圖5 不同季節的樣品屬水平熱圖Fig.5 Heatmap showing bacterial community structure at genus level in different seasons

2.3.3 種水平物種組成分析

在種水平上，16 個樣品能鑒定出447 個種，其中Y1擁有62 個種，Y2擁有39 個種，Y3有109 個種，Y4有427 個種，但各個種的豐度都較小，而且大部分為沒有得到明確種的分類（unclassified）。如表3所示，列出各組樣品在種水平上總序列數大于700的物種，其主要為未分類芽孢桿菌（Bacillus_unclassified）、未分類埃希氏菌屬-志賀菌屬（Escherichia-Shigella_unclassified）、未分類腸球菌（Enterococcus_unclassified）、產氣莢膜梭菌（Clostridium_perfringens_NCTC_8239）和未分類腸桿菌（Enterobacter_unclassified），與在屬水平分析的物種組成結果差異不大。結果表明，從種水平上看，不同季節的樣品各相同物種序列數差異大且多樣性更為復雜，在表中樣品細菌種類多但豐度小難以進行明確的分類。

表3 不同季節樣品種水平物種組成Table 3 Bacterial community composition at genus level in different seasons

3 討 論

目前對于禽蛋類殼表面細菌的菌群結構研究大部分以雞蛋為主[21]，而鴨蛋表面的細菌菌群多樣性分析較少。這是因為，盡管資料表明，從蛋白質方面看鮮鴨蛋及其制品的營養價值與鮮雞蛋相當，甚至在脂肪和礦物質含量上優于雞蛋，可作為雞蛋的有益補充，完善膳食結構[22]，但消費者對雞蛋的認知度高、需求量大，雞蛋的產銷量高于鴨蛋，雞蛋更容易成為人們研究的熱點；另外，長期以來，鴨蛋多被生產加工成皮蛋和咸蛋等蛋制品；鴨蛋的污染菌種類多而復雜，普通的菌落計數培養基無法觀察到，比如硝化螺旋菌門[23]（Nitrospirae）、米氏硫胺素芽孢桿菌（Aneurinibacillus）等有著嚴格的培養要求，其深入研究有一定難度[24]。由于鴨的生活習性與雞有差別，2 種禽蛋殼被污染的菌群有一定區別，石一等[25]從3 個不同養殖場取樣分析雞蛋殼表面多樣性結果得出其表面細菌以厚壁菌門和放線菌門為主。從本實驗不同季節鴨蛋殼表面的細菌菌群多樣性分析結果表明，鴨蛋殼表面菌群35 個門，其中最主要的是厚壁菌門（Firmicutes）和變形菌門（Proteobacteria），比雞蛋殼物種豐度高些。

在生產過程中，蛋鴨自身感染是鴨蛋殼表面污染菌的影響因素之一，養殖場會在秋季人工強制的方法讓母鴨換羽[26]，使鴨短期內還能繼續產蛋，這會導致鴨子身體虛弱，入冬時天氣濕冷，導致病鴨增多，因此產蛋少且質量不好。本實驗的菌群多樣性分析出有部分腸道致病菌：芽孢桿菌是導致食品腐敗的主要因素之一[27]；腸球菌是一類存在于人和動物消化道內的致病菌，其中糞腸球菌能破壞腸道內DNA，同時產生一定的有害化學物質，誘發直腸癌[28]；埃希氏菌屬-志賀菌屬也是一種腸道致病菌，引起細菌性痢疾[29]。測序結果中還發現：梭菌是嚴格厭氧菌屬，很難分離培養，與長期使用抗生素有關[30]，易引發炎癥；假單胞菌致腐敗能力強，存在于糞便和肉類產品中[31]；產堿菌屬存在于水和土壤以及脊椎動物腸道中，是常見的專性好氧型寄生菌，易受感染；還有一部分沒能明確屬水平的腸桿菌科等。

禽蛋殼表面細菌的微生態系統是受多個因素影響的結果，楊伊磊等[32]采用細菌菌落總數進行測定，得出結果認為造成禽蛋表面細菌污染的主要原因均受飼養場的空氣、飼料、墊草的細菌污染。Shi Yi等[33]對不同面積，不同貯藏時間的雞蛋蛋殼微生物群研究，認為蛋殼上微生物群的結構、豐度和組成因不同環境和不同時期而異。姜慧繪等[34]研究不同天氣對新鮮鴨蛋蛋殼的細菌污染情況，實驗表明在陰冷潮濕天氣條件下，新鮮鴨蛋蛋殼細菌群落總數、大腸菌群數不同程度高于晴朗高溫天氣。與本實驗聚類熱圖分析的冬季（Y4）菌群相對豐度高于其他3 個季節的結果相似。

4 結 論

以不同季節鴨蛋蛋殼洗液樣品為研究對象，通過Illumina MiSeq測序技術對樣品殼表面中細菌16S rRNA基因進行測序，從稀釋性曲線證明本實驗的測序結果具有代表性和真實性。結果表明，16 個樣品均具有較高的菌群多樣性，且各個時期都有相似的優勢菌屬：厚壁菌門的芽孢桿菌屬和腸球菌屬，分別占比17.78%和17.16%；變形菌門的埃希氏菌屬-志賀菌屬占比17.14%。季節變化對鴨蛋表殼的菌群結構有一定影響。芽孢桿菌和腸球菌在秋季相對于春季的豐度高些，而大腸桿菌屬-志賀菌屬受季節氣溫影響最為明顯，在冬季減少，來年春季氣溫上升并生長迅速，夏季氣溫繼續升高而豐度降低，秋季時豐度增高。夏季和秋季樣品的多樣性較低，但其優勢菌種的相對豐度較高，占比可達80%。冬季樣品的蛋殼表面細菌菌群多樣性和相對豐度最高，也最為復雜，更有研究表明蛋殼的污染菌會侵入蛋內容物，冬季產蛋加大造成污染的風險，要在冬季時加強產蛋鴨的營養需求和生產管理。綜上所述，本實驗在門、科、屬和種水平上全面地分析鴨蛋表面細菌的多樣性以及其季節性變化，分析表面細菌對鴨蛋腐敗變質的潛在影響，強調了養殖場按季節變化分期管理和定期衛生管理的重要性，為進一步禽蛋污染研究提供一定參考。